论文部分内容阅读
背景三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate, ATP)是体内重要的能量分子及嘌呤神经递质,可激活P2受体调节大脑功能,特别是P2X7受体,激活后可引起细胞迅速去极化,引发胞外Ca2+内流,影响细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)。而反复持续的刺激P2X7受体可使其形成大的膜孔,允许900D以下有机阳离子及ATP本身自由通过。细菌脂多糖(LPS)处理会引起胶质细胞内白介素-1β前体(pro-IL-1β)急剧增多并逐渐聚集,随后施加ATP能刺激白介素-1p(IL-1β)的成熟与分泌,促进炎症的发生与发展。硫化氢(Hydrogen sulfide, H2S)是继CO、NO后被人们认可的第三气体信号分子,近年来的研究结果证实H2S对损伤细胞具有保护作用。然而H2S的保护作用是否与ATP-P2X嘌呤信号通路有关则鲜有报道。本实验在研究ATP-P2X嘌呤信号通路的基础上探究H2S的影响及作用机制,试图明确二者间的联系并发现H2S神经保护作用的重要分子机制与靶点。目的制备ATP损伤大鼠小胶质细胞模型,探讨硫化氢(H2S)对抗ATP诱导大鼠小胶质细胞损伤中的作用和机制。方法1 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞存活率的影响1.1含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基培养大鼠小胶质细胞。实验取对数期分化较好的细胞,吹打均匀,以1×105/L的细胞密度接种于96孔培养板中,37℃,5%C02培养24h,随机分为4组：(1)空白对照组：只含培养基,不含细胞。(2)正常对照组：大鼠小胶质细胞常规培养,不给予ATP处理(即0 mmol/L ATP)。(3) ATP组(分别用0.3 mmol/L、1 mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP)。不同浓度的ATP诱导大鼠小胶质细胞3h, MTT法检测细胞存活率。1.2细胞处理方法同1.1,随机分为5组,正常对照组、ATP组、NaHS (100、200、 400μmol/L)+ATP组。不同浓度的NaHS预孵育30 min后再加入3mmol/L ATP处理3h,并且NaHS始终存在于反应体系中。MTT法检测每组细胞存活率,Ommol/L ATP组为对照组,其存活率定为100%。2 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜孔形成的影响2.1对数期分化良好的细胞吹打均匀后,以1x105/L的细胞密度接种于96孔培养板中,随机分为：正常对照组,ATP组(0.3 mmol/L.1 mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP)。ATP与YO-PRO-1 (2μmol/L)同时加入体系作用1h后,酶标仪检测荧光强度。2.2对数期分化良好的细胞吹打均匀后,以1×105/L的细胞密度接种于96孔培养板中,随机分为4组,正常对照组、ATP组、NaHS+ ATP组、KN-62 (P2X7受体拮抗剂)+ATP组。其中ATP为3mmol/L, NaHS 为200μmol/L, KN-62为500mmol/L。NaHS或KN-62预孵育30min后,同时加入ATP和YO-PRO-1作用1小时,酶标仪检测荧光强度。3 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞P2X7受体表达的影响对数期分化良好的细胞吹打均匀接种于60mm培养皿中,随机分为3组,正常对照组、ATP(3mmol/L)组、NaHS (200μmol/L)+ATP组。Western blotting俭测P2X7受体表达水平。4 NaHS对ATP-LPS激活的大鼠小胶质细胞IL-1β释放的影响对数期分化良好的细胞吹打均匀后接种于60mm培养皿中,随机分为5组,正常对照组、ATP组、LPS组、ATP+LPS组、NaHS+ATP+LPS组。其中ATP为3mmol/L,LPS为1μg/mL, NaHS为200μmol/L。药物处理顺序依次为首先使用NaHS预孵育30min,加入LPS处理9h后,再给予ATP处理3h(即各组LPS处理时间均为12h),全部药物处理结束后,收集各组细胞上清液,离心后依照试剂盒说明书操作,检测各组细胞培养上清液中IL-1β含量。结果1NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞存活率的影晌1.1不同浓度的ATP对大鼠小胶质细胞存活率的影响 以正常对照组细胞存活率为100%,0.3mmol/L ATP组细胞存活率为95.17%,与对照组无明显差异(P>0.05)。但1mmol/L、3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP组细胞存活率分别为83.03%、72.13%、68.40%、52.50%,都明显低于对照组,均有统计学意义(P<0.01)。1.2不同浓度的NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞存活率的影响 分别给予100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L NaHS预孵育30min后,再加入3mmol/L ATP处理3h。以正常对照组细胞存活率100%,100μmol/LNaHS+ATP、200μmol/LNaHS+ATP、 400μmol/LNaHS+ATP组细胞存活率分别为78.41%、91.56%、82.97%,其中200μmol/LNaHS+ATP组细胞存活率明显高于单纯ATP组(P<0.01),表明NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞损伤的保护作用具有浓度依赖性,浓度为200μmol/L已达到最佳,400μmol/L的保护作用没有进一步增加(P>0.05)。2 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜孔形成的影响2.1不同浓度的ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜孔形成 酶标仪检测胞内YO-PRO-1(分子量625D)荧光强度代表膜孔形成。分别给予Ommol/Lμ0.3mmol/L、1mmol/L、 3mmol/L、5mmol/L、10mmol/L ATP作用大鼠小胶质细胞1h,以正常对照组(0 mmol/L ATP组)荧光强度为100%,其他各组分别为100.31%、107.86%、112.96%、143.17%、151.82%。其中3mmol/L、5mmol/L及10mmol/L ATP组细胞内荧光强度均显著高于正常对照组(P<0.05)。表明,ATP可以引起大鼠小胶质细胞膜孔形成,且胞内YO-PRO-1荧光增强取决于ATP浓度,也即具有浓度依赖性。2.2 NaHS与KN-62对ATP诱导的大鼠小胶质细胞膜孔形成的影响 使用NaHS或KN-62预孵育后,再给予ATP处理,两组细胞内YO-PRO-1荧光强度分别为101.17%、102.23%,均明显低于3mmol/L ATP组的荧光强度(P<0.01)。说明NaHS及KN-62都能明显对抗ATP诱导的膜孔形成,降低细胞对YO-PRO-1通透。3 NaHS对ATP诱导的大鼠小胶质细胞P2X7受体表达的影响Western blotting结果显示,3mmol/L ATP处理3h后,大鼠小胶质细胞P2X7受体蛋白表达明显增加。而先给予200μmol/L NaHS预孵育后再加入ATP, P2X7受体蛋白表达水平较单纯ATP处理组相比明显下降(P<0.05),显示NaHS能抑制ATP诱导的P2X7受体蛋白的表达。4 NaHS对ATP-LPS激活的大鼠小胶质细胞释放IL-1β的影晌检测细胞上清液内IL-1β水平来反映大鼠小胶质细胞的激活。结果单纯ATP处理组或LPS处理组细胞上清液内IL-1p水平与对照组相比均无明显差异(P>0.05)。而ATP+LPS组无论与单纯ATP处理组相比还是与LPS处理组相比,IL-1β水平均有明显升高(P<0.05)。但在ATP+LPS组处理前30min加入NaHS,细胞上清液IL-1β水平则明显低于ATP+LPS组(P<0.05)。表明ATP或LPS均不能引起大鼠小胶质细胞IL-1β的释放,而ATP与LPS的联合作用则能激活大鼠小胶质细胞,释放IL-1β, NaHS预孵育能抑制ATP与LPS联合引发的大鼠小胶质细胞的激活及IL-1β的释放。结论胞外高浓度的ATP可降低大鼠小胶质细胞活力、上调P2X7受体表达、促进膜孔形成；ATP与LPS联合作用可激活大鼠小胶质细胞, 增多IL-1β的释放。而NaHS能明显逆转ATP的上述作用,提示嘌呤信号通路在NaHS细胞保护中的重要作用。