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血小板是哺乳动物血液中的重要细胞成分之一，主要起凝血作用。大量的研究数据表明，血小板生成素(TPO)是血小板形成过程中一个最重要的细胞因子。但有研究结果显示TPO并不是必不可缺，在TPO基因敲除小鼠中，巨核细胞和血小板减少85％，但小鼠仍然正常发育，这提示还有其它的代偿机制，或有未发现的其他配体蛋白在血小板缺失的情况下替代TPO的作用。本实验室曾用血小板生成素受体胞外区域(Mpl-EC)为钓饵，从人体胎儿肝脏cDNA文库中筛选出与血小板生成素受体(Mpl)互相作用的新配体蛋白—hNUDC(humannuclear distribution protein C，hNUDC)。通常认为，NUDC在哺乳动物细胞仅行使核迁移的功能，但是本实验室前期的结果表明，hNUDC与Mpl有较强的结合，并通过酵母双杂交实验和免疫共沉淀(IP)的研究方法，将TPO、hNUDC两个配体与受体Mpl-EC的结合区域确定在Mpl-EC-D1(102-251 aa)区域。
本论文以上述研究为基础，进一步深入地研究两配体TPO或hNUDC与受体Mpl的具体结合部位。根据实验设计的要求，需要纯度较高且数量较大的TPO、hNUDC蛋白质作为研究材料。为了满足实验的需要，我们分别采用毕赤酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统一二氢叶酸还原酶扩增系统(CHO-dhfr-)来表达两种配体蛋白。通过优化一系列诱导表达条件，成功地表达了hNUDC，蛋白表量可达500μg/L，但未能成功表达TPO蛋白。为此，我们使用哺乳动物细胞表达系统——二氢叶酸还原酶扩增系统(CHO-dhfr-)来表达两种配体蛋白。通过酸钙法将构建好的哺乳动物细胞表达载体pCDNA3.1-TPO-His和pCDNA3.1-TS-hNUDC-His，分别与pSV2-dhfr载体共转染到二氢叶酸还原酶缺陷型细胞系(CHO-dhfr-)。经过G418抗性及培养基营养缺陷筛选，得到了能够高效分泌表达TPO-His蛋白和hNUDC-His的稳定系。表达得到的蛋白采用Ni亲和层析一步法纯化，纯度可达95％以上。BCA法测定两种配体蛋白的浓度，并估算其表达量，TPO-His为2.8μg/106cells/24h，hNUDC-His为1.5μg/106cells/24h。
了进一步定位Mpl-EC(102-251 aa)与两配体TPO或hNUDC结合的最小区段，先以EBP晶体结构为模板，模建得到Mpl-EC-Dl的3D结构。再根据受体3D结构模型，将Mpl-EC-D1(102-251 aa)分成5小段，并将其cDNA分别克隆到噬菌体载体中，最终以噬菌体衣壳蛋白的形式展示在噬菌体表面。然后分别用ELISA筛选能与两配体有效结合的噬菌体。结果，Mpl-EC-D1(206-251 aa)区段是TPO和hNUDC共同的有效结合微区域。为进一步阐明两配体与受体结合的具体氨基酸位点。通过一系列丙氨酸置换突变的工作，突变了15个相关氨基酸位点，通过噬菌体ELISA结合分析，得到位于Mpl-EC-D1(206-251 aa)两个疏水性氨基酸Lue-228和Lue-230对hNUDC与受体的结合有重要作用；而Asp-235和Leu-239对TPO与受体的结合起关键作用。另外，为了证明WGSWS保守序列与TPO或hNUDC结合是否有关，本论文将WGSWS进行缺失突变后，分别于两配体进行了结合实验，结果显示，和野生型相比较，缺失突变WGSWS的受体与hNUDC结合下降19％，而该突变对TPO与受体的结合影响并不显著。
总之，本论文利用哺乳动物表达系统(CHO-dhfr-)成功筛选得到高效分泌表达TPO或hNUDC的稳定细胞株；确定了受体上与两配体TPO或hNUDCD结合相关的氨基酸位点。为进一步模拟hNUDC和Mpl或者TPO和Mpl复合体提供必要的数据。并且对深入了解TPO和hNUDC在血小板产生过程中的生物学功能提供实验依据。