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口蹄疫（Foot-and-mouth disease,FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FMDV）引发的一种侵害猪、牛、羊等偶蹄动物的重大烈性传染病。该病的暴发和流行严重危害家畜的生产力和畜产品质量,影响发病地区的经济发展、国际贸易和社会稳定。因此,该病一直是100多年来全世界兽医学家研究的焦点。FMDV是小RNA病毒,极易发生变异,尤其是其结构蛋白VP1。VP1蛋白氨基酸的变化常会改变FMDV的稳定性、致病性、复制特性和免疫原性等,因此分析FMDV VP1氨基酸的变化,对FMD新型疫苗的研制具有重要的指导意义。本研究以FMDV O型Cathay和ME-SA/Pan-Asia谱系不同时期疫苗株为参照,比对不同谱系毒株、不同时期经典疫苗株和我国当前流行株（SEA-Mya98谱系）VP1蛋白氨基酸序列,选择参照毒株保守或相对保守的几个氨基酸,采用反向遗传学操作技术,替换嵌合感染性cDNA中Mya/98 VP1的氨基酸,研究这些氨基酸对FMDV抗原性、稳定性、复制特性和免疫原性的影响。1.在已构建含当前流行毒株VP1（SEA-Mya98谱系）基因嵌合全长克隆中分别引入了3个（VP1:H28Q+S47Q+V194I）、6个（VP1:H28Q+S47Q+S58A+V194I+A198Q+S212L）和7个（VP1:H28Q+S47Q+S58A+V194I+S197D+A198Q+S212L）氨基酸的替换,构建了三个重组全长质粒pQFA、pQFE和pQFC。线化的重组质粒转染BSR/T7细胞,获得的基因工程病毒经RT-PCR、核苷酸序列测定、间接免疫荧光和电镜观察,结果说明成功拯救出三株含目标突变氨基酸的FMDV,表明在嵌合F MDV VP1结构蛋白中引入3、6和7个氨基酸的替换并未影响活的FMDV的拯救。2.三株基因工程病毒与亲本病毒具有相似的噬斑大小和生长动力学,在37℃处理3h、6h、9h和42℃处理0.5h、1h后的热稳定性明显低于亲本病毒（P<0.05）,但对乳鼠的致病力(LD50)可提高4倍以上。说明在嵌合FMDV VP1结构蛋白中引入3、6和7个氨基酸的替换并未明显影响基因工程病毒的噬斑表型和复制能力,但热稳定性在一定程度上有所下降,并明显增强了对乳鼠的致病力。3.将对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV O/HN-7/2010（SEA-Mya98）、O/HK/CHA/99（ME-SA/PanAsia）、O/GX/CHA/2009（Cathay）的细胞适应毒分别在乳鼠上连续传4代,获得了对C57BL/6小鼠敏感的FMDV O/GX/CHA/2009MF4和O/HN-7/2010MF4株,它们对C57BL/6小鼠的LD50分别为104.2和104.5。将乳鼠上传代4次仍对C57BL/6小鼠不敏感的FMDV O/HK/CHA/99MF4经C57BL/6小鼠（1次）和胎猪肾细胞（FPK）（2次）循环适应传代9轮,在传至第5轮时,该病毒能够致C57BL/6小鼠发病和死亡,且随着传代次数的增加对C57BL/6小鼠的致病力增强,其中第5轮和第9轮传代病毒对C57BL/6小鼠的LD50分别为102.8和105.1。这些对C57BL/6小鼠敏感FMDV株的获得为未来FMDV致病性以及以C57BL/6小鼠为实验模型的效力评估奠定了基础。4.三株基因工程病毒（r-FMDV/MyVP1-A、r-FMDV/MyVP1-C、r-FMDV/MyVP1-E）和亲本病毒（r-FMDV/MyVP1）大量增殖,制备FMD灭活疫苗,并用不同剂量（1μg和2μg146S抗原）分别免疫豚鼠,14d、21d、28d和35d后收集血清,测定中和抗体。结果表明:不同剂量抗原免疫豚鼠诱导产生的中和抗体水平,均随免疫时间的延长而逐渐升高,在免疫28d或35d时抗体水平达到最高。基因工程病毒（r-FMDV/MyVP1-A、r-FMDV/MyVP1-C）疫苗不同剂量免疫豚鼠后,中和对应病毒的抗体滴度均明显高于亲本病毒免疫豚鼠产生的中和抗体滴度（P<0.05）。三株基因工程病毒不同剂量免疫豚鼠后中和亲本病毒的抗体滴毒均明显低于亲本病毒免疫豚鼠中和自身产生的抗体滴毒（P<0.05）。用四种灭活疫苗免疫豚鼠制备的血清分别中和FMDV O/HN-7/2010、O/HK/CHA/99,O/GX/CHA/2009,并计算制疫苗病毒与三个谱系流行毒株的抗原匹配性（r值）,结果表明相比亲本病毒,基因工程病毒与流行毒株的抗原匹配性降低了。综上结果表明,在嵌合FMDV VP1结构蛋白中引入3、6和7个氨基酸的替换疏远了基因工程FMDV与亲本病毒的抗原关系,变窄了与流行毒株的抗原谱,但突变3、7个氨基酸后可明显增强其免疫原性。5、四种FMD灭活疫苗分别免疫C57BL/6小鼠,28d后用100 LD50的FMDV三个谱系流行毒株攻击,结果表明四种疫苗免疫的C57BL/6小鼠均能有效抵抗三个谱系FMDV流行株的攻击,获得100%的保护,这一结果与免疫豚鼠血清测得的抗原关系结果不一致,推测可能与高剂量抗原（0.8μg）免疫小鼠所致,这与先前报道的高剂量抗原免疫导致异源攻毒获完全保护的结果一致。攻毒前的小鼠血清抗体检测结果也表明所有免疫小鼠均获得较高的保护性特异性抗体水平（均大于1:32）,亲本病毒疫苗免疫小鼠诱导产生的抗体水平均高于基因工程病毒疫苗免疫小鼠诱导产生的抗体水平,这与免疫豚鼠产生的中和抗体结果一致。本研究首次报道了在FMDV VP1结构蛋白引入多个氨基酸的（6个和7个）替换对FMDV稳定性、致病性、复制特性和免疫原性等的影响,为未来通过修饰改造研制优良FMD疫苗候选毒株提供了理论依据。