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目的:二甲双胍(metformin)做为一线降糖药物,具有抗肿瘤,延缓衰老等多种药理作用[1]。近年研究发现二甲双胍具有良好的抗炎,抗焦亡功效[2-4]。肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)是重症手足口病的主要病因之一。EV71病毒感染引起的焦亡激发机体炎症过度,因此抑制焦亡可能成为治疗EV71感染的新策略。常用的抗炎药物存在引发胃溃疡等副作用[5,6],二甲双胍具有调节机体代谢,氧化,副作用低的特点。二甲双胍做为临床一线降糖药,已经应用到大量的病人的临床治疗过程中本课题使用EV71感染胃上皮细胞(GES-1),观察二甲双胍的抗焦亡作用,并在EV71感染的GES-1细胞模型上探索二甲双胍抑制细胞焦亡的作用机制,为治疗EV71感染提供更多依据。方法:1.使用不同MOI的肠道病毒71型(Enterovirus 71,EV71)病毒感染GES-1细胞24小时,通过细胞计数试剂盒8(Cell Counting Kit-8,CCK8)测定细胞活力水平,评价EV71对细胞增殖活力的影响,用乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒测定细胞损伤水平,评价EV71对细胞损伤情况的影响,Western blot测定核苷酸结合寡聚结构域样受体家族3(NLR family,pyrin domain containing 3,NLRP3)、Gasdermin D protein(GSDMD)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1(Caspase-1)、白介素1β前体(Pro-IL-1β)蛋白水平,检测EV71感染对细胞焦亡水平的影响。用固定MOI的EV71病毒感染GES-1细胞不同时间,Western blot测定NLRP3、Caspase-1、Pro-IL-1β蛋白水平。用免疫荧光染色标记NLRP3炎症小体蛋白,高内涵成像观察NLRP3水平和聚集情况。2.EV71病毒和不同浓度二甲双胍干预GES-1细胞,用CCK8法检测细胞活力变化,用LDH释放试剂盒检测细胞损伤情况,用1,1’-二十八烷基-3,3,3’,3’-四甲基氨基氰高氯酸盐(Dil)染色标记细胞膜用荧光显微镜观察细胞膜损伤情况,分析病毒及二甲双胍干预对细胞膜的影响作用。3.用EV71病毒和2mM的二甲双胍干预GES-1细胞24h,用Western blot测定Caspase-1、Caspase-1 P20、Pro-IL-1β蛋白水平。用固定MOI病毒和不同浓度二甲双胍干预GES-1细胞,用Western blot测定NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Caspase-1P20、Pro-IL-1β蛋白水平,评估二甲双胍在EV71感染细胞模型的抗焦亡作用。4.EV71病毒感染GES-1细胞24小时,用Western blot测定DEPTOR水平。用固定MOI的EV71病毒感染GES-1细胞不同时间,Western blot测定DEPTOR蛋白水平。用不同浓度二甲双胍干预GES-1细胞24小时,用Western blot测定DEPTOR水平。用固定MOI病毒和不同浓度二甲双胍干预GES-1细胞,用Western blot测定DEPTOR蛋白水平,研究二甲双胍在感染细胞模型对DEPTOR的影响。5.过表达DEPTOR之后用EV71病毒感染GES-1细胞,通过Western blot检测GES-1细胞内DEPTOR、NLRP3、GSDMD、Caspase-1、Caspase-1 P20及Pro-IL-1β蛋白水平,研究GES-1细胞内过表达DEPTOR对病毒诱导细胞焦亡的影响。结果:1.EV71以剂量依赖的方式降低了GES-1细胞活力,并造成了细胞损伤,EV71上调了细胞内NLRP3的水平,抑制了GSDMD、Pro-IL-1β的水平,抑制了Caspase-1的活化,具有时间依赖和剂量依赖性。免疫荧光显示EV71导致了细胞内NLRP3的点状聚集。2.二甲双胍干预可抑制EV71感染诱导的GES-1细胞损伤:CCK8结果显示低于二甲双胍干预可以减轻EV71对细胞活力的抑制;LDH结果显示随着二甲双胍干预剂量的增加,培养上清液中LDH释放减少。3.二甲双胍可抑制EV71诱导的GES-1细胞焦亡:免疫印迹结果表明焦亡相关蛋白在二甲双胍后发生明显变化且呈剂量依赖,病毒引起上调的细胞内NLRP3蛋白水平随二甲双胍浓度增加而下降,病毒诱导的GSDMD、Caspase-1、Pro-IL-1β的降解随二甲双胍干预浓度的增加而减少。4.EV71感染引起细胞内DEPTOR蛋白水平降低:WB数据显示DEPTOR蛋白水平随着EV71感染时间和剂量的增加而下降;二甲双胍干预可引起细胞内DEPTOR水平升高;二甲双胍可抑制EV71感染诱导的细胞内DEPTOR水平的降低。5.GES-1细胞内过表达DEPTOR可抑制EV71感染引起的GES-1细胞焦亡:免疫印迹结果显示过表达DEPTOR能抑制病毒引起的焦亡相关蛋白的表达,使NLRP3蛋白水平下降,GSDMD、Caspase-1、Pro-IL-1β蛋白水平的增加。结论:1.EV71可以降低细胞活力,造成细胞损伤并诱导细胞焦亡。2.二甲双胍可提高EV71感染细胞的活力,缓解EV71引起的细胞损伤,抑制了EV71造成的细胞膜破裂。3.二甲双胍可抑制EV71导致的细胞焦亡。4.二甲双胍可上调EV71感染细胞中的DEPTOR蛋白水平。5.DEPTOR可抑制EV71感染诱导的细胞焦亡。