论文部分内容阅读
铁离子参与肺炎克雷伯菌DNA复制、蛋白质的合成和能量的传递,对于肺炎克雷伯菌的生长和繁殖至关重要。然而,铁离子在宿主体内的溶解性极低,且大部分铁离子与蛋白相结合。例如,宿主体内大部分的铁都位于红细胞内的血红蛋白中,由血红素携带;而在血浆中的铁则与转铁蛋白结合;其他细胞内的铁则储存在铁蛋白中。可见,宿主体内可供肺炎克雷伯菌利用的铁含量极少。因此肺炎克雷伯菌进化出了多种铁摄取系统（包括铁载体、血红素摄取系统和铁离子摄取系统等）,与宿主竞争铁。本研究分为三部分,逐步探讨铁摄取系统与肺炎克雷伯菌毒力机制的关系。第一部分主要是阐述肺炎克雷伯菌获得性铁载体（沙门菌素、耶尔森菌素和气杆菌素）编码基因簇在浙江省的分子流行病学特征并探究肺炎克雷伯菌的黏性表型和铁载体之间的关系。本研究收集了2017年浙江省20家三级医院的肺炎克雷伯菌272株,收集临床资料并对菌株进行全基因组测序。在272株非重复菌株中,符合临床标准的hv Kp有123株,另有149株属于非hv Kp。核心基因组分析提示,非hv Kp亲缘关系较近,而hv Kp群体间的基因背景多样性较大。我们着重分析了肺炎克雷伯菌获得性铁载体的分子流行病学特征。耶尔森菌素的ybt位点的定位最常见于ICEKp3（99/208,47.6%）和ICEKp10（69/208,33.2%）。耐药克隆ST11及其单位点突变体ST4496携带的ybt位点以ybt9为主,且全部位于ICEKp3上;高毒力克隆ST23携带的ybt位点以ybt1为主,主要位于ICEKp1和ICEKp10上。气杆菌素和沙门菌素位点iuc和iro在本研究中的阳性率分别为80.9%（220/272）和55.5%（151/272）。其中,146株（53.7%）同时携带iuc和iro位点。在所有iuc或iro阳性的菌株中,iuc1和iro1所占比例最高,这两个位点通常位于p K2044-like毒力质粒（Kp VP-1）上。此外,伴随着菌株分泌铁载体的种类的增加,菌株的黏性水平也随之增加,提示铁载体产量和黏性水平存在一定的相关性,而rmp A/rmp A2参与其中。此部分研究结果明确了铁载体耶尔森菌素、沙门菌素和气杆菌素的编码基因簇在肺炎克雷伯菌中遗传多样性及分布,揭示了铁载体和黏性表型之间可能存在的协同互作关系。第二部分主要研究了大肠杆菌素I受体Cir A摄铁能力的差异对肺炎克雷伯菌毒力及对头孢地尔敏感性的影响。Cir A是儿茶酚类铁载体的非特异性受体。基于第一部分研究中收集的272株肺炎克雷伯菌,我们分析了cir A等位基因的分布。分析发现cir A1是hv Kp的优势等位基因型,而在非hv Kp中,以cir A198最常见。Cir A1和Cir A198存在2个氨基酸的差异,分别位于桶状结构的侧边和loop区。为了排除其它肺炎克雷伯菌儿茶酚类铁载体特异性受体的影响,我们构建了肠杆菌素受体基因fep A的敲除株ZKP51Δfep A和fep A与沙门菌素受体基因iro N的双敲除株D3Δfep AΔiro N,在此基础上研究Cir A1和Cir A198的差异。在限铁环境中,与Cir A198相比,Cir A1具有更强的转运铁载体的能力,且赋予肺炎克雷伯菌更强的血清抵抗能力。Cir A也是新型抗菌药物头孢地尔入胞的重要门户,将野生型cir A1突变成cir A198后,菌株对头孢地尔的MIC增加4倍;而将野生型cir A198突变成cir A1后,菌株对头孢地尔的MIC下降4倍。可见,Cir A的摄铁能力可影响肺炎克雷伯菌对头孢地尔的敏感性。此外,转录组分析提示,Cir A1和Cir A198摄铁能力的差异可影响ABC转运器和菌毛相关调控基因的表达。此部分研究结果表明,Cir A1的摄铁能力比Cir A198强,由此导致Cir A1赋予肺炎克雷伯菌更强的适应性和血清抵抗能力,以及对头孢地尔更高的敏感性。第三部分研究主要探究肺炎克雷伯菌血红素摄取系统Hmu RSTUV的遗传多样性及其功能。此部分研究收集了2242个肺炎克雷伯菌基因组,其中有2218株（98.9%）具有完整的hmu RSTUV序列。基于2218个完整的hmu RSTUV序列的等位基因分布,我们建立了hm ST的分型策略。在这2218株全基因组序列中,我们共识别出446个非重复的hm ST型。hm ST在高毒力克隆中的分布较为分散,其中hm ST1主要出现在ST23的菌株中。相比之下,hm ST8在多重耐药克隆中的分布则比较集中。hm ST在高毒力克隆、血流感染菌株、临床感染菌株以及社区获得性感染菌株中的多样性较高。与野生株相比,hmu R敲除株在含牛血红素的M9中表现出了生长劣势,证明了Hmu R摄取血红素的功能。然而,在全血中,野生株和敲除株并未呈现生长差异。此外,hmu R的敲除株铁载体产量显著增加,提示hmu R的缺失可能反馈性地增强铁载体的表达。此部分研究主要建立了hmu RSTUV的分型方法hm ST,并基于hm ST描述hmu基因簇的分子流行病学,以及相关流行hm ST型和肺炎克雷伯菌流行克隆之间的关系,最后验证了血红素摄取受体Hum R的体外功能及其对铁载体的影响。综上,本研究揭示了浙江省肺炎克雷伯菌获得性铁载体的分子流行病学特征,并研究了其中儿茶酚类铁载体的非特异性受体Cir A与毒力和头孢地尔敏感性的关联;同时对另一铁摄取系统——血红素摄取系统Hmu RSTUV的遗传多样性进行分析。