具有降解毒死蜱功能的复合菌群构建及其降解特性研究

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毒死蜱是一种具有中等毒性的有机磷广谱杀虫剂。近年来,随着一些高毒性的有机磷化合物被限制使用,毒死蜱也因此被用于各种重要经济作物害虫的防治之中。但毒死蜱的大量使用,导致其在土壤和水中过量累积,从而对环境造成了严重的污染。在消除毒死蜱污染的方法中,生物修复法比传统的物理和化学方法(光解、fnton氧化法、化学氧化法和多相光催化降解等)在去除环境中有机磷污染方面,具有高效、廉价、无污染和无二次残留等特点,因此,生物修复法成为在环境修复领域中的研究热点。本研究以湖北省某农药生产公司,在废水处理过程中的活性污泥为材料,进行降解毒死蜱农药耐受性驯化,通过6个月驯化后,对活性污泥在驯化过程中微生物多样性进行测定,并分析出优势菌群,然后再从活性污泥中筛选到3株既能降解毒死蜱,又能降解毒死蜱中间代谢产物3,5,6-三氯-2-吡啶醇(TCP)的菌株,并对其进行复配,构建出高效降解毒死蜱的复合菌群(MLCF7)。进一步地,对复合菌群降解毒死蜱的特性进行研究。优化了复合菌群降解毒死蜱的条件;探讨了复合菌群降解TCP的效果;采用HPLC法对复合菌群降解毒死蜱的代谢中间产物进行了分析,并用FTIR对中间产物进行了表征;同时采用扫描电镜观察了复合菌群降解毒死蜱过程中的表面形貌;对复合菌群降解毒死蜱的代谢产物进行生测实验,最后对复合菌群降解土壤中的毒死蜱效果进行了初步研究。采用高通量测序的方法,研究不同浓度毒死蜱和不同来源的活性污泥这两个环境因子,对活性污泥中微生物种群及群落结构的影响。结果表明:随着驯化过程中毒死蜱浓度的增大,活性污泥中的一些高效降解毒死蜱的菌株被富集起来,并且不同来源活性污泥样本之间群落结构也有明显的差异。当毒死蜱的浓度为400 mg/L时,活性污泥MLCa中主要优势菌群有:副球菌属(Paracoccus sp)、肠杆菌属(Enterobactersp)和甲基菌属(Methylobacillus sp)等,MLCp中主要优势菌群有:克雷伯氏菌属(Klebsiellasp)、假黄单胞菌属(Pseudoxantthomonas sp)和无色杆菌属(Achromobactersp)等,MLCs中主要优势菌群有:沙雷式菌属(Serratiasp)、芽孢杆菌属(Bacillus sp)和假单胞菌属(Pseudomonassp)等。将驯化稳定的三种活性污泥(MLCa、MLCp、MLCs)的菌悬液在以毒死蜱和TCP为唯一碳源的MSM平板上划线分离,得到7株(MLCa-1、MLCa-2、MLCp-1、MLCp-2、MLCp-3、MLCs-1 和 MLCs-2)能同时降解毒死蜱和 TCP的菌株。其中MLCa-1、MLCp-2和MLCs-1这三种来自不同活性污泥的单菌摇瓶培养7 d后,对100 mg/L的毒死蜱降解效率分别达到53.71%、51.85%和65.37%,对这3株单菌进行16S rRNA基因序列测序鉴定,经序列比对发现:MLCa-1为副球菌属、MLCp-2为克雷伯氏菌属、MLCs-1为沙雷式菌属。将这3株菌株按照1:1:1的比例进行复配,得到复合菌群(MLCF7),其摇瓶培养7d后,对100 mg/L毒死蜱的降解效率相对于单菌有了明显的提高,降解率达到80.96%。对复合菌群(MLCF7)降解毒死蜱的条件进行优化,实验表明,MLCF7在7 d内完全降解50 mg/L毒死蜱,而对250 mg/L毒死蜱降解率只有30.54%。MLCF7降解毒死蜱最适pH和温度分别为:8和31 ℃,其降解率分别为:88.79%和86.77%。另外,外加物质(葡萄糖、胰蛋白胨和酵母提取物)的添加能促进MLCF7对毒死蜱的降解。MLCF7对毒死蜱中间代谢产物TCP也有一定的降解作用,摇瓶培养7 d后,对50 mg/L TCP的降解效率达到62%。对MLCF7降解毒死蜱机理进行研究,高效液相检测结果表明,从开始降解到第3d,TCP的液相峰面积逐渐增大,第3d时达到最大,随后减少,到第7 d时,毒死蜱和TCP的液相峰均消失;采用傅里叶红外光谱对MLCF7降解毒死蜱中间代谢产物进行表征,结果显示第7 d之后,毒死蜱的主要特征峰(836.95、954.59、1018.23、1405.85和1536.98 cm-1)消失,说明毒死蜱被降解为其他的小分子物质,与HPLC分析结果相吻合;采用扫描电镜观察复合菌群降解不同浓度毒死蜱时,菌群细胞表面形态发生的变化,当毒死蜱的浓度为500 mg/L时,细胞变形,由椭圆状变为棒杆状。以果蝇为指示生物,对MLCF7降解毒死蜱的代谢产物进行毒性评价,结果显示,毒死蜱降解3 d之后的产物,对果蝇的毒性大大降低,果蝇的存活率为66.66%,空白果蝇培养基上果蝇的存活率为:80%,由此可见,MLCF7能降解毒死蜱,生成毒性很小的物质。对MLCF7降解土壤中毒死蜱的效果进行测定,结果表明,复合菌群能高效的降解土壤中的毒死蜱,当培养42 d之后,土壤中毒死蜱的浓度由最初的300 mg/L降到25.71 mg/L,降解效率达到91.43%。综上所述,将分离得到的三株副球菌、克雷伯氏菌和沙雷式菌进行复配,构建的复合菌群(MLCF7),对毒死蜱的降解效果比单菌的效果更好,而且既能高效降解毒死蜱,又能较好地降解毒死蜱中间代谢产物TCP,能将毒死蜱降解为毒性很小的其他物质,此外,复合菌群还能降解土壤中高浓度的毒死蜱。可见,构建的复合菌群在毒死蜱污染的环境修复方面有良好的应用情景。
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