背景：脑胶质瘤是颅内最常见的恶性神经上皮细胞肿瘤,约占颅内肿瘤的50%。综合发病年龄高峰在30-40岁之间。目前脑胶质瘤的治疗主要有手术、放疗、化疗、生物靶向治疗等手段,但由于肿瘤生长速度快并呈浸润性生长,以及对放化疗介导的细胞凋亡不敏感等恶性生物学特性,总体治疗疗效不佳,复发率高,预后差,所以明确关键的致癌途径,寻找脑胶质瘤新的预后指标和治疗靶点至关重要。TIP30(Tat-interactive protein30)是一相对分子质量为30KD的转录共分子,基因定位于人类第11号染色体,可与人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)转录辅助因子Tat蛋白结合,调节蛋白Tat的转录活性,从而特异性地提高HIV的增殖。近年来国内外多项研究均提示TIP30其实是一种新的抑癌基因,它在人类正常组织如心、脑、肺、肾、胰腺中广泛表达,但在乳腺癌、肺癌、肝癌、胃癌、肠癌、涎腺癌等多种恶性肿瘤中低表达甚至缺失。目前研究发现TIP30主要是通过延缓细胞生长,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤新生血管生成,调节DNA损伤修复,调节细胞对葡萄糖的耐受性,调节细胞内外大分子物质的转运,增加肿瘤细胞对化疗的敏感性等多种功能起到抑制肿瘤发展的作用。尽管TIP30在多种恶性肿瘤中的作用逐渐明朗,但目前有关TIP30与脑胶质瘤之间的相关性报道仍较少,TIP30在脑胶质瘤中是否也充当着抑癌基因的角色尚不清楚。表皮生长因子受体(epidermal growth factor Receptor, EGFR)是一种跨膜糖蛋白,分子量170Da,属于酪氨酸激酶型受体,通过与EGF等配体结合后激活下游信号传导通路如MAPK/ERK、PI3K/AKT等从而介导肿瘤细胞分化、生长、迁移、侵袭、黏附和细胞损伤修复等一系列过程。研究发现EGFR基因在人脑恶性胶质瘤中常常出现扩增、重排、突变和过度表达,其下游AKT、ERK等信号通路蛋白在也存在过表达与共表达,借助于信号转导使细胞生长失控和转化,并且与胶质瘤的恶性程度呈正相关。有关TIP30与EGFR之间的关系目前也是研究的热点。肖华等研究发现在TIP30基因敲除的小鼠中,EGFR下游通路上调,自发性肺肿瘤的发生率增高。进一步研究证实TIP30可与细胞膜上ACSL4、Endophilin B1等物质形成复合物,影响早期内涵体环节的EGFR分选,加速EGFR和配体EGF的分离,促进EGFR向溶酶体的分选和降解,从而终止EGFR下游信号通路的传导,达到抑制肿瘤发展的作用。但是目前在脑胶质瘤中TIP30与EGFR的相关关系尚未清楚,TIP30是否也可以通过下调EGFR及其下游信号传导通路来发挥其生物学作用,需要我们进一步研究证实。目的：本实验旨在研究TIP30在脑胶质瘤组织和正常脑组织中蛋白表达情况的差异,及其与脑胶质瘤患者临床病理特征、预后之间的关系。然后进一步在细胞水平验证TIP30对脑胶质瘤细胞生长、迁移、侵袭、凋亡等功能的影响。最后探讨TIP30与EGFR两者在脑胶质瘤中的相关关系。材料与方法：1.主要的实验材料1.1组织标本收集南方医科大学附属南方医院2006至2011年脑外科收治的92名脑胶质瘤患者术后石蜡病理组织。其中男性40人,女性52人,中位年龄35岁。所有病人术前未进行放化疗,且均经病理组织学诊断为脑胶质瘤。其中星型胶质细胞瘤42例,少突胶质细胞瘤25例,胶质母细胞瘤25例。病理分级WHO Ⅰ-Ⅱ级42例,Ⅲ-Ⅳ级50例。肿瘤大小≥5cm有47例,<5cm有45例。另取10例癫痫病人手术后脑组织作为对照。本实验已经通过医院医学伦理委员会的同意批准。1.2实验试剂兔抗人的TIP30多克隆抗体,兔抗人EGFR单克隆抗体,兔抗人的pAKT和pERK单克隆抗体,辣根过氧化物酶标记山羊抗兔二抗,DAB显色剂,苏木素,无水乙醇,95%酒精,1%盐酸酒精,RIPA裂解液,SDS-PAGE凝胶配置试剂盒,Trizol、逆转录试剂盒及SYBR Green I荧光定量试剂盒,胎牛血清,high-glucose DMEM,转染试剂Iipo2000,质粒提取试剂盒,MTT, Matrigel基底胶,Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒等。1.3实验仪器恒温孵箱,流式细胞仪,电泳槽,PCR扩增仪,冰箱,光学显微镜,高速离心机,电子天平秤,载玻片,盖玻片,培养皿,吸管,微量移液器,试管,EP管,冻存管等。2.细胞培养选取脑胶质瘤细胞株U87进行实验,培养条件为10%胎牛血清+高糖的DMEM,37℃,5%CO2培养箱中孵育。显微镜下可见细胞胞体呈多角形,突起细长。3.实验流程3.1TIP30和EGFR蛋白在脑胶质瘤组织中的表达采用免疫组织化学法检测92例脑胶质瘤和10例对照组脑组织石蜡切片中TIP30和EGFR表达情况的差异。并且分析两者蛋白表达的相关关系。切片经脱蜡、抗原修复及血清封闭后,加入TIP30抗体或EGFR抗体,4℃过夜。次日复温45min后PBS冲洗,加入二抗,室温下孵育1h,显色,苏木素复染,显微镜下观察。评分标准采用半定量双盲法,即400倍高倍镜下随机选择5个视野,每个视野计数200个细胞。染色结果分别以显微镜下观察细胞显色程度和比例计分。细胞显色程度：无显色计0分,浅黄色计1分,棕黄色计2分,棕褐色计3分；显色细胞比例：<10%计0分,10%-30%计1分,31%～60%计2分,>60%计3分。两项分值的乘积>2分者视为TIP30或EGFR蛋白阳性表达。3.2TIP30和EGFR蛋白表达与脑胶质瘤病人临床病理特征及预后之间的关系收集92例脑胶质瘤病人的临床资料,按照患者的性别(男、女)、年龄(≥35、<35岁)、病理类型(星型胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、胶质母细胞瘤)、病理分级(WHO Ⅰ-Ⅱ级、Ⅲ-Ⅳ级)、肿瘤大小(≥5cm、<5cm)对TIP30(?)EGFR进行分层分析。同时电话随访病人的生存情况,进行TIP30单因素和多因素生存分析,评价TIP30是否是脑胶质瘤病人的独立预后指标。3.3TIP30对脑胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等生物学功能的影响采用慢病毒转染的方法使脑胶质瘤细胞株U87过表达TIP30,并设立空载体对照组和未处理组,免疫印迹及RT-PCR验证稳定转染效率。之后进行细胞生物学功能实验,其中包括MTT比色法检测细胞生长增殖情况；划痕实验检测细胞迁移能力；transwell实验检测细胞侵袭能力；流式细胞仪检测细胞凋亡情况,评价TIP30对脑胶质瘤细胞恶性生物学功能的影响。3.4TIP30与EGFR在脑胶质瘤中的相关关系慢病毒转染使脑胶质瘤细胞株U87过表达TIP30后,免疫印迹的方法检测过表达株中EGFR.及其下游信号传导通路中的两种主要蛋白pAKT和pERK的表达量是否也随之改变,初步探讨TIP30是否可以影响EGFR及其下游通路来发挥其生物学作用。4.数据分析采用SPSS13.0统计软件分析。TIP30及EGFR在脑胶质瘤和正常脑组织之间、两者与患者临床病理参数之间的比较采用Pearsonχ2检验；体外细胞实验数据结果以平均数±标准差的形式表示(实验重复三次,至少两次实验是在同一实验条件下完成),组间的比较采用Student-t检验。相关性采用Sperman相关分析,单因素生存分析采用Kaplan-Meier法,多因素生存分析采用COX风险比例回归模型法。P<0.05为差异有统计学意义。结果：1.TIP30和EGFR蛋白在脑胶质瘤组织中的表达92例脑胶质瘤组织中,TIP30的阳性率为54.3%(50/92),而正常脑组织中的阳性率达90.0%(9/10),差异具有显著性(P=0.03)。相反,EGFR在脑胶质瘤中的表达阳性率明显高于正常脑组织(57.6%vs20.0%,P=0.04)。Sperman相关性分析提示TIP30与EGFR蛋白在脑胶质瘤组织中的表达存在着负相关关系,相关系数为-0.57,P<0.01。2.TIP30和EGFR蛋白表达与脑胶质瘤患者临床病理特征的关系TIP30蛋白表达同脑胶质瘤患者的年龄、性别无关,而与病理类型、肿瘤分级和肿瘤大小呈负相关(P<0.05)。单因素生存分析提示TIP30阳性表达组总生存时间明显长于阴性表达组(26.4vs20.6个月,P=0.019)。多因素分析则表明TIP30也是脑胶质瘤患者的独立预后指标之一(P=0.043)。与此相反,EGFR蛋白表达则与脑胶质瘤患者恶性程度较高的病理类型、分化差的高级别肿瘤和较大的肿瘤大小相关(P<0.05)。EGFR表达阳性的患者的总生存时间也明显短于表达阴性者(21.3vs27.0个月,P=0.021)。3.TIP30抑制脑胶质瘤细胞增殖、迁移、侵袭和促进细胞凋亡慢病毒转染使脑胶质瘤细胞株U87稳定过表达TIP30后,肿瘤细胞无论是生长增殖速度、迁移速度还是侵袭的速度都较对照组明显减慢,但细胞早期凋亡的数量过表达组却较对照组明显增多,差异均具有统计学意义(P<0.05)。4.TIP30负性调节EGFR及其下游信号传导通路蛋白的表达慢病毒转染使脑胶质瘤细胞株U87稳定过表达TIP30后,EGFR蛋白的表达量较空载体对照组明显减少,除此之外,EGFR下游信号通路蛋白pAKT和pERK的表达量也随之下调,说明TIP30可以负性调节EGFR及其下游信号传导通路的蛋白表达。结论：1.TIP30在脑胶质瘤组织中表达下调,它与患者的年龄、性别无关,但与患者病理类型、分级、肿瘤大小和总生存时间密切相关,同时也是脑胶质瘤病人一个独立的预后因素。2.TIP30可以诱导脑胶质瘤细胞凋亡和抑制细胞增殖、侵袭和转移,发挥着抑癌基因的作用。3.TIP30在脑胶质瘤中的抑癌作用可能是通过负性调节EGFR及其下游信号通路来实现。