背景与目的中国正快速步入老龄化社会,目前中国60岁以上老年人有约1.69亿。预计2050年中国60岁以上老年人将占三成,老龄化带来的种种困扰和问题更加严重。衰老和死亡是任何物种的个体都难以避免的最终结局,但至今我们对衰老发生机制的理解还相当有限。鉴于其重要性,衰老一直是生物学研究的热点。经过多年的研究,现在关于衰老的机制已经提出多种学说,每种学说都有其优势和不足。诸如自由基学说、遗传程序学说、差错灾难学说、交联学说、脂褐素累积学说、内分泌功能减退学说等,分别从不同的角度探讨了衰老发生的机制和对策。近50年的理论和实验证实,自由基学说是最有说服力的衰老学说之一。给动物连续注射D-半乳糖后,因其代谢产物半乳糖醇不能进一步代谢而堆积在细胞内,导致细胞肿胀,致使动物组织细胞出现衰老的退行性变以及功能的改变。同时D-半乳糖在体内产生的大量自由基超过机体的清除能力,引发脂质过氧化的链式反应,产生大量的脂质过氧化物丙二醛,加重对细胞的损伤。D-半乳糖致衰老动物模型的造模方法简便易行,价格低廉,结果稳定,目前已成为国内公认的衰老动物模型。因此本实验采取D-半乳糖制备亚急性衰老模型。骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来源于胚胎发育早期中胚层的一类多能干细胞,是全身结缔组织的干细胞。大量实验证实MSCs在合适的体外分化条件下,不仅可以分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、肌肉细胞等间质细胞,而且可以跨胚层分化为外胚层的神经元、神经胶质细胞和内胚层的肝细胞。并且MSCs具有移植后不发生排斥反应的特点。随着对MSC的深入研究,目前认为MSCs除了具有多向分化潜能,还能在损伤局部反应性分泌多种神经营养因子。这些因子能够促进局部血管增生、组织再生等,从而起到了治疗损伤的作用。近年来随着对衰老的深入研究,目前认为衰老是一种与基因相关的疾病,已经发现某些基因与细胞衰老密切相关。它们可概括为细胞周期调控基因、端粒酶调控基因、生长抑制蛋白基因、DNA/蛋白质合成与修复基因等。衰老还与一些转录因子(反式作用因子)的基因表达或活性改变有关。其中具有细胞增殖调控功能的衰老有关基因有抑癌基因p21、抑癌基因p16、抑癌基因p53、细胞周期素D1 (cyclin D1)、周期素依赖性激酶2 (cycli-n-dependent kinase 2,CDK2)、视网膜神经母细胞瘤蛋白(Rb)、增殖细胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen, PCNA)、转录因子(A-P-1 E2F)等。这些基因之间相互联系,可能构成细胞衰老的基因调控链。所以本课题将初步探讨MSC是否会影响p16、p21及PCNA的表达,这可能是间充质干细胞发挥抗衰老作用的机制之一综上所述,我们拟在研究间充质干细胞逆转衰老的作用,并且从衰老相关基因来探讨MSCs抗衰老的机制。本研究将为间充质干细胞发挥抗衰老提供理论与实践基础。如能取得预期效果,经过良好设计的基础研究后,其临床前景广阔。实验方法第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定用贴壁培养法分离、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,为MSCs的生物治疗奠定基础。无菌条件下取大鼠股骨和胫骨,收集细胞悬液。离心后加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养基,接种于培养瓶中,置于培养箱中培养。待贴壁细胞生长达80-90%融合时传代。取生长良好的P3代MSCs进行检测：①观察MSCs形态并做苏木精-伊红染色。②MTT法和克隆形成实验测定生长曲线和克隆形成能力；③流式细胞仪检测MSCs细胞表面抗原标记和细胞增殖周期；④在地塞米松、左旋VitC、β-磷酸甘油等作用下向成骨细胞诱导分化；在地塞米松、重组人胰岛素的作用下向脂肪细胞诱导分化。第二部分制备衰老模型,研究间充质干细胞在衰老大鼠体内的迁移。①衰老模型的制备选用清洁级SD大鼠,每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,连续注射4个月,制作衰老模型。取大鼠血清,测定各组大鼠血清中SOD活性和MDA含量。②分别从青年对照组和衰老模型大鼠的骨髓中培养出间充质干细胞(MSCs)。倒置显微镜下观察细胞形态及生长情况,流式细胞术(FCM)检测表面抗原,比较两组原代细胞集落形成数量和增殖情况,透射电镜观察其形态和结构变化。③体外培养纯化大鼠骨髓间充质干细胞至第三代,用表达绿色荧光蛋白(GFP)的病毒载体转染MSCs细胞,在显微镜下观察未转染MSCs和转染MSCs的形态并在荧光显微镜下观察GFP表达情况,检测MSCs-GFP的细胞活性和细胞周期,通过流式细胞仪检测GFP对细胞表面标志(CD29, CD34, CD44, CD45)表达的影响。④调整GFP标记间充质干细胞浓度为3×107/mL,将3×106个MSCs通过尾静脉回输给衰老大鼠,应用荧光显微镜检测MSCs的迁移。第三部分间充质干细胞逆转衰老的效果SD大鼠30只,随机均分为3组：对照组、衰老模型组和MSCs治疗组。衰老模型组大鼠每日皮下注射D-半乳糖400mg/kg,连续4个月。MSCs治疗组在衰老模型制备成功后,给予尾静脉输注3×106个MSCs。①实验结束后,取大鼠血清,测定各组大鼠血清中SOD和MDA；全自动分析仪及酶标仪检测雌二醇(E2)、孕酮(P)、促黄体生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)、睾酮(T)；以及血钙(Ca)、碱性磷酸酶(ALP)。②取各组大鼠胸腺、脾脏、卵巢和睾丸,HE染色后,观察各组织结构的差异。③称重法测定大鼠胸腺指数和脾脏指数；用MTT法测定脾脏淋巴细胞增殖活性；ELISA法测定胸腺IL-7.IL-10和IL-2含量,以及脾脏IL-10和IL-2的含量；流式细胞仪检测胸腺中CD4+CD8+T细胞；透射电镜检测胸腺组织结构。④骨密度扫描仪测量各组大鼠骨密度(BMD)；利用扫描电镜对大鼠股骨远端松质骨的形态结构进行观察。第四部分MSCS治疗衰老的机制研究实验结束时,处死各组大鼠,无菌条件下提取各个组织,应用Real-time PCR检测各组织中P16、P21和PCNA mRNA的表达。应用免疫印记法检测各组织中P16、P2、PCNA蛋白的表达。统计学方法试验资料结果用均数±标准差(x±S)表示,显著性标准为0.05,采用SPSS17.0统计软件进行统计分析。组间比较用单因素方差分析(One-Way ANOVA)；组间两两显著性比较方差齐采用LSD法,方差不齐用Dunnett’s T3和Dunnett’s C法；分析各因素的主效应和交互效应用析因方差分析；重复测量数据用重复测量方差分析；两个独立样本的总体均数比较用独立样本t检验。结果第一部分大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定利用贴壁筛选的方法分离大鼠骨髓MSCs,经传代后细胞形态呈梭形,均匀一致。将P3代细胞低密度接种到培养板,培养1周后可形成散在分布的克隆。细胞生长曲线分析结果显示接种后第三天细胞进入指数增长期,至第五天进入平台期。MSCs细胞周期检测结果显示G0+G1期的细胞约占80%以上。流式细胞仪检测显示P3代细胞均一地表达细胞表面抗原CD44、CD29,不表达CD34和CD45。经定向诱导分化后,细胞分别呈现成骨细胞、脂肪细胞的表型特征。第二部分制备衰老模型,研究间充质干细胞在衰老大鼠体内的迁移。①成功制备了D-半乳糖致亚急性衰老大鼠模型。与对照组相比,衰老模型组SOD的活性明显降低,MDA含量明显降低升高,差异有显著性意义(P<0.01)。②青年组和衰老模型组的原代和第3代骨髓间充质干细胞在形态上无差异；流式细胞仪检测显示,两组MSCs的免疫表型一致；两组细胞也都具有成骨诱导和成脂诱导能力。但与青年对照组相比,衰老模型组MSCs生长速度明显减慢,集落形成单位明显降低(P<0.05)。透射电镜观察发现,衰老模型组MSCs呈现衰老的形态和结构变化。③GFP转染后24 h即可见绿色荧光蛋白表达,72 h表达最强,此后逐渐减弱,到4周时仍可见少量表达。并且GFP对MSCs细胞的增殖、细胞形态、周期及表面抗原的表达均无影响。④绿色荧光蛋白标记MSCs回输到衰老大鼠体内,MSCs能够归巢到衰老大鼠的胸腺、脾脏、卵巢、睾丸。MSCs归巢到衰老大鼠体内第7天时,归巢的组织仍有荧光存在。第三部分间充质干细胞逆转衰老的效果①与衰老模型组相比,MSCs治疗组SOD的活性明显升高,MDA含量明显降低,差异有显著性意义(P<0.05)。酶标仪检测雌性大鼠血清中激素的水平,结果显示,MSCs治疗组与模型组相比,能够升高大鼠体内P、E2及睾酮的含量；能够降低LH、FSH的含量(P<0.05),差异具有统计学意义。各组大鼠的血清钙、碱性磷酸酶含量测定结果：与正常对照组比较,衰老模型组血清钙和ALP有所升高(P<0.05)；而MSCs治疗组与致衰老模型组相比,血清钙、ALP则明显降低(P<0.05)。②MSCs治疗组与模型组相比,能使胸腺、脾脏、睾丸和卵巢的结构得到明显改善：于100倍光镜下检测睾丸中不同萎缩程度曲细精管的百分比。结果显示,治疗组与模型组相比,能够提高正常生精管的比例,减少部分萎缩管及完全萎缩管的比例(P<0.05)。与模型组相比,治疗组的卵巢中黄体和卵泡数目增多(P<0.05),组间比较,差异具有统计学意义。③间充质干细胞可增强衰老模型大鼠的免疫功能,显著提高衰老大鼠的胸腺指数和脾脏指数,增强T淋巴细胞活性,同时增加IL-2和IL-7的表达水平；降低IL-10的表达水平。衰老模型组CD4+CD8+T细胞的百分数明显低于对照组；治疗组与模型组比较,其百分数明显升高,差异具有显著性(P<0.01)。胸腺组织的透射电镜分析结果：MSCs治疗组与模型组相比,能使胸腺组织结构得到明显改善。④骨密度扫描仪测量骨密度(BMD):MSCs治疗组与致衰老模型组相比,全身BMD有所升高(P<0.05),股骨BMD明显升高(P<0.05)。扫描电镜结果显示：与对照组相比,模型组大鼠的骨小梁变细,断裂,数量减少,微损伤增多；而治疗组与模型组大鼠相比,骨小梁数量增加,骨吸收面减少,胶原纤维排列规律、整齐。第四部分MSCS逆转衰老的机制研究Real-time PCR检测各组织中P16、P21和PCNA mRNA的表达结果显示：与模型组相比,治疗组中大鼠各组织内P16和P21 mRNA的表达降低,而PCNA mRNA的表达升高(P<0.05)。Western blot结果显示：治疗组P16及P21蛋白表达低于模型组；而PCNA蛋白表达明显高于模型组。结论1.本实验建立了一种体外稳定培养扩增大鼠MSCs的方法,培养的细胞成分单一,通过观察细胞生物学特性、流式细胞仪测定细胞表面抗原结果符合MSCs标准。适用于对BMSCs进一步的应用研究。2.衰老模型组的间充质干细胞的数目和功能都发生了改变,推测随着大鼠衰老,MSCs细胞可能也会随着衰老。因此移植青年大鼠MSCs对移植治疗会有更好的效果。3.GFP荧光稳定持久,对转染细胞的生物学特征无明显影响,并且其荧光表达时间达4周,因此可以将其作为间充质干细胞的示踪标记。经尾静脉移植的MSCs能够较长时间定位于衰老大鼠的各器官。4.本实验从功能水平、生化水平及细胞水平检测,发现间充质干细胞能够修复衰老所致大鼠组织的损伤,具有治疗大鼠衰老的作用。5.MSCs可明显下调p16和P21,上调PCNA的表达,可能是其逆转衰老的机制之一。本研究的创新点1.对免疫系统、骨质疏松的作用：间充质干细胞可增强老年大鼠免疫功能；MSCs细胞可以修复D-半乳糖所致骨质疏松症。2.衰老模型大鼠MSCs的生长速度和增殖能力发生了改变,因此移植青年大鼠MSCs作为种子细胞,对移植治疗会有更好的效果。3.通过Real-time PCR和免疫印迹方法,发现MSCs可明显下调p16和P21,上调PCNA的表达,这些基因之间可能相互联系,构成细胞衰老的基因调控链。MSCs可能通过抑制p16和P21的表达,促进细胞周期从G1期向S期进展；另一方面,MSCs可能通过抑制P21,进而释放PCNA蛋白,推进DNA合成、增殖。最终逆转组织细胞衰老。