论文部分内容阅读
目的:通过对 Hp 相关胃病（helicobacter pylori-related gastric disease,HPGD）由良性到恶性演变过程中中医证候与miR-499基因多态性及表达的变化进行研究,探索Hp相关胃病发展过程中病理变化、证候与miR-499之间的联系,为从中西医结合角度研究HPGD恶性演变提供一定的启示,并期望在将来研究成果能应用到临床,为HPGD恶性演变提供一定预测及警示作用。方法:一、病例来源:本研究所使用的胃黏膜标本均由本课题组成员于2016年10月至2017年10月在广州中医药大学第一附属医院消化内窥镜室及胃肠外科收集前来就诊符合纳入标准的受试者及胃癌患者的胃黏膜,共有213名患者,303例胃黏膜标本（每一名胃癌患者取三例标本,包括癌、癌旁和远端各一例）。本研究将标本分别按不同中医证候和不同病理改变进行分组,而实际上既无临床表现,同时病理也未见异常者几乎没有,故本研究在按证候分组中设置无证型组,在按病理分组中设置（病理）正常组以作为空白对照组。按不同证候分组结果为:脾胃湿热证94例,肝胃不和证70例,脾气虚证32例,瘀血阻滞证6例,无证型组11例。按不同病理改变分组为:炎症组57例,萎缩组8例,混合组77例,重度组10例,胃癌组47例,正常组14例。二、标本采集:本研究胃黏膜标本有两个来源,一在消化内窥镜室,于受试者进行电子胃镜检查时采集标本,镜下未见明显病变时,分别于胃窦大、小弯及前、后壁距幽门2-3cm处各钳取1块,共4块胃黏膜组织;若镜下可发现病变,则于病灶旁钳取4块胃黏膜组织。二在胃肠外科收集手术治疗胃癌患者的胃黏膜,其中分别于癌、癌旁、癌远端3个部位各剪取4块,共12块组织。上述每个位置各采集的4块组织中,1块在采集时立即行快速尿素酶检测Hp感染情况;1块浸入4%多聚甲醛液,后续经石蜡包埋、切片等,分别行美蓝染色和HE染色;剩下两块分别浸入装有RNA保存液的冻存管,并立即放入-80度低温冰箱保存,以待随后行基因多态性及miRNA表达量检测。三、实验方法:Hp检测:结合快速尿素酶及美兰染色法观察两种方法判定Hp感染与否及感染程度;病理组织学检测:采用HE染色法由资深病理科医师阅片并评估胃黏膜病理改变及其程度;miR-499基因多态性检测:采用直接测序法对miR-499 rs3746444位点上的基因多态性进行检测;miR-499表达量检测:采用荧光定量PCR对miR-499表达量进行检测。结果:一、一般资料:各组患者一般资料比较,其性别无统计学差异（P>0.05）;而对于年龄及病程,均发现胃癌组显著高于炎症组（P<0.05）,其余组间年龄及病程对比无统计学差异（P>0.05）。二、不同病理组间Hp感染率及程度比较:213例患者中,Hp阳性者共175例,Hp阴性者共38例。不同病理组间Hp感染率有统计学差异（P<0.01）,混合组、胃癌组感染率显著高于正常组（P<0.003）;混合组显著高于炎症组（P<0.003）。而从总体趋势来看,Hp感染率呈萎缩组、重度组>混合组>胃癌组>炎症组>正常组的趋势。不同病理分组间Hp感染程度不全相同（P<0.01）,萎缩组、混合组及重度组Hp感染程度显著高于正常组（P<0.01）,混合组和重度组Hp感染程度显著高于炎症组（P<0.01）,而胃癌组Hp感染程度显著低于混合组（P<0.01）。而从整体趋势来看,Hp感染程度呈重度组>混合组>萎缩组>胃癌组>炎症组>正常组的趋势。三、不同证候组间Hp感染率及程度比较:各证候组间Hp感染率有统计学差异（P<0.01）,其中脾胃湿热证组、肝胃不和证组的Hp感染率均显著高于无证型组（P<0.003）。从整体趋势来看呈现瘀血阻滞证>肝胃不和证>脾胃湿热证>脾气虚证>无证型组的趋势。不同证候组间Hp感染程度分布存在统计学差异（P<0.01）。脾胃湿热证组、肝胃不和者组及瘀血阻滞证组Hp感染程度显著高于无证型组（P<0.05）。从总体趋势来看,也呈现Hp感染程度瘀血阻滞证>肝胃不和证>脾胃湿热证>脾气虚证>无证型组的分布。四、不同病理组间中医证候分布比较:各病理组间证候分布有统计学差异（P<0.01）,混合组与正常组相比,混合组肝胃不和证显著较多,而正常组中无证型者显著更多（P<0.003）。胃癌组与炎症组、混合组比较有统计学差异,其中胃癌组脾气虚证显著较两组多,而炎症组、混合组肝胃不和证者较胃癌组显著更多（P<0.003）。五、不同证候组间各病理改变病变程度比较:不同证候组间各病变程度的比较结果中,除肠化程度的比较无统计学差异外,其余结果均显示有统计学差异（P<0.01）。其中不同证候组间炎症程度及萎缩程度的比较中,所有证型病变程度均显著高于无证型组（P<0.05）,而在炎症活动度的比较中,脾胃湿热证、瘀血阻滞证组炎症活动度显著高于无证型组（P<0.05）,而在异型增生的比较中,脾胃湿热证、肝胃不和证、脾气虚证异型增生程度显著高于无证型组（P<0.05）。而从总体趋势来看,呈现为如下趋势,不同炎症程度:瘀血阻滞证>脾气虚证>脾胃湿热证>肝胃不和证>无证型组;不同炎症活动度:瘀血阻滞证>脾胃湿热证>脾气虚证>肝胃不和证>无证型组;不同萎缩程度:瘀血阻滞证>脾气虚证>脾胃湿热证>肝胃不和证>无证型组;不同肠化程度:瘀血阻滞证>脾气虚证>脾胃湿热证>肝胃不和证>无证型组;不同异型增生程度:脾气虚证>瘀血阻滞证>脾胃湿热证>肝胃不和证>无证型组。六、不同Hp感染情况与miR-499基因多态性及其表达的关系:Hp阴性阳性组间以及不同Hp感染程度间miR-499表达量差异均无统计学意义（P>0.05）。而从趋势来看,呈现为阳性组>阴性组;重度>轻度>中度>无的趋势。Hp阴性阳性间及各Hp感染程度组间基因型分布均无统计学差异（P>0.05）。七、不同病理改变与miR-499基因多态性及其表达的关系:各病理组间基因型分布无统计学差异（P>0.05）。各病理组间A、G等位基因频率无统计学差异（P>0.05）。经拟合miR-499基因型、性别、年龄和是否感染Hp对胃黏膜病理改变的多分类logistic回归模型。结果显示,以正常组为参照时,与Hp感染阴性者相比,Hp阳性者更多发生胃黏膜混合病变（萎缩伴肠化和或轻度异型增生）及癌变,其发病风险分别是阴性者的约20倍和8倍（P<0.05）。而对于各病理组间miR-499表达量的比较,结果提示,各病理组间miR-499表达量有统计学差异（P<0.05）。胃癌组与混合组相比,miR-499表达量显著高于混合组（P<0.05）。从总体趋势来看,胃癌组中miR-499的表达量亦是最高,总体表达量呈胃癌组>重度组>炎症组>萎缩组>混合组>正常组。而不同病理组间各病理改变病变程度miR-499表达量的比较,结果提示均无统计学差异（P>0.05）。而从趋势上看,分别呈现如下趋势。不同炎症程度:中度>重度>轻度>无;不同炎症活动度:中度>重度>轻度>无;不同萎缩程度:中度>轻度>无>重度;不同肠化程度:中度>轻度>无>重度;不同异型增生程度:重度>中度>轻度>无。而胃癌病例不同位置胃黏膜间miR-499表达量比较,结果显示各位置组织标本间miR-499表达量无统计学差异（P>0.05）,从趋势来看,呈现为癌旁>远端>癌的趋势。八、不同中医证候与miR-499基因多态性及其表达的关系:各证候组间基因型分布无统计学差异（P>0.05）。各证候组间A、G等位基因频率比较也提示各组间无统计学差异（P>0.05）。而各证候组间miR-499表达量也无统计学差异（P>0.05）。从总体趋势来看,miR-499表达量呈脾气虚证组>瘀血阻滞证组>无证型组>脾胃湿热证组>肝胃不和证组趋势分布。结论:一、在胃黏膜由良性到恶性演变过程中,存在Hp感染率及感染程度随恶化程度加深而升高,但发展至癌时反而降低的趋势,且Hp阳性者较阴性者发生胃黏膜萎缩伴肠化及癌变风险显著增高,提示作为胃黏膜恶性病变的危险因素,Hp可能在病变的初起阶段作用较为明显。二、miR-499在胃癌及重度组中表达量较正常组呈增高趋势,以及在炎症和异型增生病变的重度和中度组中表达量较轻度和正常组呈增高趋势,同时在HPGD脾气虚证和瘀血阻滞证者胃黏膜组织中表达量较其他证候组亦呈升高趋势,提示其高表达可能对胃黏膜恶性病变以及脾气虚证和瘀血阻滞证的形成有一定影响。