丝状真菌转录调控蛋白Hac1是未折叠蛋白响应途径的重要调控蛋白,可介导UPR途径中分子伴侣BIP1、二硫键异构酶PDI1等相关基因表达量的上调,从而使胞外蛋白的分泌量得到提高。Hac1蛋白功能的研究可为阐明丝状真菌蛋白分泌调控机制提供基础。本研究以斜卧青霉114-2为出发菌株,利用融合PCR和巢式PCR相结合的方法构建转录调控蛋白Hac1的激活形式基因随机插入表达盒和外源蛋白r-PA随机插入表达盒,通过原生质体转化成功获得了阳性转化子。利用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行了野生菌株、Hac1过表达菌株和外源蛋白r-PA过表达菌株转录组测序。以期通过对获得了各菌株之间差异表达基因的分析,阐明Hac1蛋白在斜卧青霉蛋白分泌调控中的功能。得出以下结果:1.以增强型绿色荧光蛋白为报告基因,以组成型表达基因gpdA启动子为表达盒启动子,构建了转录调控蛋白Hac1激活形式基因荧光随机插入表达盒。利用原生质体转化法转入野生菌株114-2后,经PCR初步验证,得到了Hac1基因的阳性转化子。经在麸皮培养基上培养2-4d后,可在菌丝内部清晰的观察到强烈的绿色荧光信号,显示成功构建了Hac1激活形式基因随机插入过表达菌株Hac1-YGSJ。2.以人工合成的r-PA基因全长为模板,以诱导型纤维素酶CBHI启动子和信号肽为指引序列,成功构建了外源蛋白r-PA基因随机插入表达盒。利用原生质转化野生菌株114-2,经传代培养和PCR初步验证,得到了基因组整合有外源蛋白r-PA基因的阳性转化子。阳性转化子经培养2-3天,收集的发酵液在含活性底物平板上能产生明显的酶解圈,显示构建的r-PA过表达菌株r-PA能在诱导型纤维素酶CBHI信号肽的指引下分泌有活性的r-PA蛋白至胞外发酵液中。3.以act为内参基因,利用实时荧光定量PCR分别对野生菌株114-2在以麸皮-纤维素为碳源、外源蛋白r-PA过表达菌株和Hac1激活形式基因过表达菌株的bipA、pdiA、xyn10A、cel7A和cel7B的转录情况,最终确定48h的总RNA样品适合进行转录组分析。4、利用Illumina HiSeqTM 2000测序平台进行各菌株转录组测序,经测序质量评估后,clean reads过滤、SOAP2比对、参考序列的覆盖度等分析后确定最终可用于后续分析的reads。对各菌株表达的基因进行了可变剪接、新转录本预测及注释、SNP分析,发现菌株114-2存在10351个可变剪切、428个新转录本和1048个SNP;菌株Hac1-YGSJ菌株存在10776可变剪切、423个新转录本和1244个SNP;菌株r-PA存在11459个可变剪切、471个新转录本和174个1SNP。菌株114-2和菌株Hac1-YGSJ的差异表达基因分析结果显示,Hac1-YGSJ菌株中2700条基因表达量上调、1042条基因表达量下调,这些差异表达基因主要。菌株r-PA与野生菌株比较2488条基因表达量上调、695条基因表达量下调。转录组结果分析结果显示Hac1活性形式基因的过表达和外源蛋白r-PA都能引起细胞产生未折叠蛋白响应,使参与内质网中蛋白质折叠、蛋白质转移、糖基化修饰、膜泡运输等相关部分基因表达量的上调。