实验目的：本次研究的主要目的是评估人脐带间充质干细胞(human umbilical cord derived mesenchymal stem cells HUCMSCs)作为软骨组织工程的种子细胞的可行性,同时评估II型胶原复合糖胺聚糖支架材料作为软骨组织工程种子细胞载体的可行性。主要包括了三部内容：一.人脐带间充质干细胞的培养、传代、冻存、复苏以及鉴定,对其生物学特性进行初步的研究,为组织工程学种子细胞的研究提供实验基础；二.II型胶原复合糖胺聚糖支架的制作及其理化性质的鉴定；三.利用人脐带间充质干细胞在Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架体外培养成软骨组织,并对培养出的软骨组织进行鉴定。实验方法：1.利用昆明总医院临床试验科细胞室提供的原代人脐带间充质干细胞,用含10%的胎牛血清、100U/mL青霉素、100mg/L链霉素的DMEM/F-12培养基进行培养,待其生长至贴壁覆盖约80%-90%时按1：3比例进行传代,并在倒置显微镜下观察HUCMSCs的生长、增殖情况及其形态变化。取原代、第三代细胞进行流式细胞仪检测。用胰蛋白酶/EDTA消化液将传代的细胞消化,1000转/分钟下离心5分钟,将离心的最下层细胞以FBS配制的10%二甲基亚砜重置,-80℃冰箱保存24小时后将其转入液氮罐内保存,3个月后取出进行复苏、培养、传代及流式细胞术。2.通过将软骨粉碎后行脱细胞处理,制备II型胶原复合糖胺聚糖多孔支架,在扫描电镜下进行观察,测定支架材料的孔径、孔隙率,并测试其亲水性,对支架材料进行相应的组织学及生化分析。3.分离培养P3代的人脐带间充质干细胞,并将配制好的人脐带间充质干细胞混悬液均匀的移植到经辐照消毒后的II型胶原复合糖胺聚糖支架上,不加诱导剂,用含10%的胎牛血清的DMEM/F-12培养基进行培养,3周后取出部分样品进行甲苯胺蓝和番红精O染色,并行II型胶原免疫组化染色。实验结果：1.在细胞接种后约3小时,即可见少量的脐带间充质干细胞开始在培养瓶中贴壁生长,细胞形态呈梭形、纺锤形,少部分可呈集落生长；在接种24小时后可见大多数细胞已完成贴壁生长；第3天至第4天左右可见细胞贴壁覆盖程度达到80-90%,显微镜下观察见：细胞呈均一的梭形生长,类似于成纤维细胞,呈典型的漩涡状排列生长。细胞在传代过程中形态并无明显变化,在细胞传至第3代时即剩下形态较为单一的细胞。流式细胞检测分析显示：原代培养的HUCMSCs已经开始高表达CD44、CD90、CD105,但是仍有一定程度的表达CD34、CD45,而第三代的HUCMSCs则高度表达CD29、CD44、CD90、CD105等间充质细胞标志,几乎不表达CD34、CD45等内皮细胞、造血细胞标志及主要组织相容性抗原人白细胞DR抗原。HUCMSCs冻存3个月后复苏,显微镜下观察显示细胞形态饱满,细胞活性良好,传代生长良好,与冻存前基本一致,流式细胞检测其表面标志物的测定结果与未冻存的HUCMSCs类似。2.Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料为白色、多孔的泡沫状圆柱体,表面孔隙较多,扫描电镜下可见：支架材料呈多孔泡沫状,孔隙分布均匀,孔隙之间相互贯通,支架孔隙率为：(91.8%±2.17)%,孔径平均,孔径值在110--230μm之间,支架材料亲水性良好,吸水膨胀率为(213.71%±1.31)%。甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组化染色呈阳性。3.Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料随着细胞培养的时间逐渐变的表面光滑,质地有韧性,可观察到有软骨样组织形成,并逐步变多,甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组化染色均呈阳性。结论：1.人脐带间充质干细胞经检测显示符合间充质干细胞的基本生物学特性,可以作为软骨组织工程良好的种子细胞来源；2.Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料具备适合细胞生长、增殖的孔径和孔隙率,亲水性及生物相容性良好,可以作为软骨组织工程良好的细胞载体；3.人脐带间充质干细胞在Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料上体外可以不经诱导而初步构建组织工程软骨,为软骨损伤的修复奠定了一定的实验基础。