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第一部分:基于转录组测序研究酚类环境雌激素对人子宫肌瘤细胞增殖的影响背景:子宫肌瘤是女性生殖系统中最为常见的良性肿瘤,雌激素是子宫肌瘤发生与发展的促进剂。环境雌激素作为环境内分泌干扰物中的一类,通过消化和吸收的方式进入人体并且蓄积,发挥其内分泌干扰物的作用。因子宫肌瘤为雌激素依赖性的肿瘤,其同样也是环境雌激素潜在的靶标。人类接触环境雌激素较多的是双酚A（Bisphenol A,BPA）、壬基酚（Nonylphenol,NP）等酚类环境雌激素,是体外摄入雌激素的重要来源。现有的研究表明酚类环境雌激素与子宫肌瘤的发生和发展有关联,而酚类环境雌激素对于子宫肌瘤发生发展的影响及作用机制目前尚不十分清楚。目的:本研究旨在探讨酚类环境雌激素对子宫肌瘤细胞影响的机制,探明其作用的潜在分子靶点和信号通路。方法:成功构建人子宫肌瘤原代细胞系后,采用CCK-8实验检测酚类环境雌激素BPA和NP对子宫肌瘤细胞增殖的影响,流式细胞实验检测BPA、NP对子宫肌瘤细胞细胞周期的影响。在最佳干预浓度及时间干预子宫肌瘤后,收集BPA组、NP组及对照组样品,进行转录组高通量测序（RNA sequencing,RNA-seq）及数据分析。筛选出受BPA和NP共同影响的差异表达基因。然后,对这些差异表达的基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）富集、京都基因和基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG）通路富集和蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-protein Interaction,PPI）分析。定量实时聚合酶链反应（Quantitative real-time polymerase chain reaction,q-PCR）和蛋白质印迹法（western blot,WB）用于验证差异表达的基因转录水平及蛋白质表达水平。结果:酚类环境雌激素BPA和NP均促进了人子宫肌瘤细胞的G1/S细胞周期的转变,并促进了细胞增殖。测序结果显示BPA组与对照组相比差异表达基因数为1288个,NP组与对照组相比差异表达基因数为3735个。受NP和BPA两者共同调控差异表达基因数为739个,其中包括255个上调和484个下调基因。BPA和NP共同调控的739个差异表达基因GO富集分析显示,最富集的GO条目是结缔组织发育、有丝分裂细胞周期的G1/S过渡和细胞外基质。KEGG信号通路富集分析结果表明,差异表达的基因主要富集在环境信息处理、人类疾病和细胞过程三个主要途径中,其中细胞周期、PI3K-AKT信号通路富集明显。q-PCR和western blot验证结果显示BPA和NP干预后,细胞周期及细胞增殖相关基因和蛋白质上调且激活了 PI3K-AKT信号通路。结论:酚类环境雌激素BPA和NP促进人子宫肌瘤细胞增殖及细胞周期G1/S的转变。BPA和NP暴露后子宫肌瘤细胞中与细胞增殖和细胞周期相关的基因E2F1、CCND1、CCNE2、MCM2、MCM3、MCM4、MCM5、MCM6 等表达上调,同时PI3K-AKT信号通路的激活可能也起着关键作用。此外,酚类环境雌激素作为外源性物质刺激细胞,可促进子宫肌瘤炎症因子IL-6、IL-8的上调。第二部分:整合RNA-seq和ChIP-seq揭示XBP1在双酚A促进人子宫肌瘤细胞增殖中的重要作用背景:BPA是研究最多的代表性酚类环境雌激素。本课题的第一部分研究结果表明BPA促进了子宫肌瘤细胞增殖,RNA-seq结果表明BPA引起了人子宫肌瘤细胞基因表达水平的改变。人子宫肌瘤细胞受到BPA干预后,需要经过一系列复杂的基因调控网络快速、准确、协调的的变化以适应BPA的干扰。这一复杂的生物进程离不开转录调控及染色质修饰的调控,转录因子和表观遗传修饰在这过程中发挥着极其关键的作用。目的:该研究的目标是深入分析BPA通过表观遗传调控对关键基因表达的影响且鉴定BPA诱导的人类子宫肌瘤细胞增殖中的关键转录因子,并进行功能验证,为暴露于BPA和其他类似作用的内分泌干扰物的发病机制提供理论基础和新见解。方法:用0.1%DMSO或10.0μmol/L BPA处理原代培养的子宫肌瘤细胞系48小时后,进行组蛋白3赖氨酸27乙酰化（histone 3 lysine 27 acetylation,H3K27ac）染色质免疫共沉淀结合高通量测序（Chromatin Immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq）。结合上部分实验中的RNA-seq数据进行整合分析确定了关键转录因子（Transcription factor,TF）、靶基因和信号通路。为了确认子宫平滑肌瘤组织中TF和靶基因的表达水平,使用western blot分析了 10个人类子宫平滑肌瘤组织和匹配的邻近子宫平滑肌组织,并通过免疫组织化学（Immunohistochemistry,IHC）分析了 96个配对石蜡包埋的人类子宫样本。ChIP实验用于确认TF和目标基因之间的组合。为了验证关键TF的功能,使用慢病毒敲低转录因子的表达水平并检测对细胞增殖、细胞周期和细胞成瘤性的影响。同时使用western blot分析以确认下游信号通路是否被激活。结果:第一部分研究中通过RNA-seq找出的BPA干预子宫肌瘤细胞过程中转录水平发生改变的基因,此部分实验中通过H3K27ac ChIP-seq找出了 BPA干预子宫肌瘤细胞过程中乙酰化修饰水平发生改变的基因。ChIP-seq和RNA-seq数据的整合分析确定了H3K27ac修饰水平下诱导的差异表达基因和关键转录因子XBP1及其靶基因ITGA2。实验结果发现,与子宫肌层组织相比,子宫平滑肌瘤中XBP1蛋白水平高表达。此外,敲低XBP1基因可抑制体内和体外子宫肌瘤细胞的增殖同时抑制BPA对子宫平滑肌瘤细胞的促进增殖的作用。ITGA2在人子宫肌瘤组织中高表达。IHC结果证实ITGA2与XBP1表达显着相关（R=0.6708,P＜0.001）,ChIP实验显示XBP1与ITGA2预测的启动子区域结合。KEGG信号通路富集结果显示PI3K-AKT信号通路明显富集,且ITGA2是PI3K-AKT信号通路富集中的基因,所以进一步表明下游PI3K/AKT通路被激活。结论:本研究目前的工作揭示了 BPA促进子宫肌瘤细胞增殖的新机制,XBP1转录因子调节ITGA2基因的表达并激活下游PI3K/AKT通路。通过实验证实XBP1在BPA对子宫肌瘤细胞增殖影响中起重要调节作用,为研究暴露于BPA和其他类似内分泌干扰物相关的发病机制提供了新的见解,并且XBP1可作为干预和治疗子宫肌瘤的候选分子靶点。