目的:先天性梗阻性肾病（Congenital obstructive nephropathy,CON）是儿童终末期肾病的主要原因,同时也是导致肾移植的第二位原因,其典型病理改变为肾间质纤维化。在CON的众多病因中,肾盂输尿管连接部梗阻是较为常见的一种。现有研究表明手术解除梗阻后并不能完全逆转梗阻后肾间质纤维化的进程。与此同时,先天性肾单位数目的减少会阻碍梗阻性肾损伤的恢复,并进一步导致额外的肾单位丢失。因此,阐明梗阻性肾病肾脏损伤的发病机制,寻找相应的关键靶分子及潜在的干预靶点,并采取相应的干预措施,对于延缓或逆转肾间质纤维化的进展,进而挽救肾脏功能具有重要的临床意义。特定的表观遗传修饰可以沉默或增强由DNA转录引发的基因表达模式,从而引起病理改变或疾病的发生。同时,表观基因组及转录组会随着环境、生理或病理等的变化而变化,从而对各种刺激的转录反应做出更细微和更具体的适应性变化。目前研究提示多种表观遗传机制（如DNA和组蛋白的非共价修饰以及非编码RNA的调控等）均不同程度地参与了慢性肾脏疾病肾纤维化的发生发展过程及相关病理改变。然而,RNA的化学修饰在输尿管梗阻引起的肾间质纤维化病理过程中的作用尚不明确。在目前已报道的多达170种RNA转录组水平的化学修饰中,N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是真核生物mRNA和长链非编码RNA转录后最常见的修饰方式。m6A修饰在细胞中的功能众多,现已知其参与细胞分化、癌症进展、昼夜节律、精子发生、神经功能和性别决定以及X染色体失活等诸多生物学过程。m6A修饰位点附近的序列具有高度保守性的特点,mRNA上m6A修饰主要发生在RRm6ACH（R:嘌呤;H:非鸟嘌呤）序列的腺嘌呤上,主要在转录起始区、蛋白质编码区（Coding sequence,CDS）和3’非翻译区（3’untranslated region,3’UTR）等区域分布。其中,CDS的终止密码子附近和3’UTR的前1/4处是m6A修饰发生的最常见区域。与DNA甲基化和组蛋白修饰相似,m6A修饰也是个可逆的过程。不同刺激信号作用下,m6A甲基转移酶和去甲基化酶动态识别修饰位点,阅读蛋白读取m6A修饰信号以及下游功能复合物的募集等,共同介导了mRNA的不同生物学过程。所以,把m6A修饰酶的动态调控作为研究的切入点,有望在一定程度上阐明疾病发生的表型和细胞信号通路中所涉及的潜在mRNA的m6A修饰机制。基于此,本研究通过构建小鼠左侧输尿管完全梗阻（Complete unilateral ureteral obstruction,CUUO）模型,检测CUUO术后肾组织总RNA的m6A修饰水平、m6A修饰酶[包括m6A甲基转移酶3（Methyltransferase-like protein 3,METTL3）、甲基转移酶14（Methyltransferase-like protein 14,METTL14）、肾细胞瘤1-结合蛋白（Wilms’tumour-associated protein,WTAP）、去甲基化酶脂肪量和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein,FTO）及Alk B同源蛋白5（Alk B Homolog 5,ALKBH5）]以及肾纤维化中上皮间充质转化（Epithelial mesenchymal transition,EMT）标志物等指标表达的动态变化。同时,借助RNA甲基化免疫共沉淀（Methylated RNA immunoprecipitation,MeRIP）及高通量测序技术绘制CUUO术后7天m6A修饰图谱,筛选并验证具有明显m6A修饰差异的转录本。在此基础上,体外通过构建敲减及过表达慢病毒来改变METTL3的表达,检测小鼠肾小管上皮细胞（Mouse renal tube epithelial cells,TCMK-1）总RNA的m6A修饰水平、细胞活性、细胞凋亡及EMT标志物的改变。同时,验证METTL3参与LZTR1 mRNA m6A修饰的调节。本研究相关内容将为进一步阐明RNA甲基化m6A修饰参与梗阻性肾间质纤维化的病理生理机制提供重要实验证据。研究方法:1、CUUO模型的构建和肾间质纤维化指标、m6A修饰水平、m6A修饰酶的检测:（1）构建C57雄鼠CUUO模型及假手术模型,于术后1、3、5、7和14天收集血清及肾组织标本;（2）采用苦味酸比色法、脲酶法分别检测血清中肌酐和尿素氮的含量;（3）采用比色法、实时荧光定量PCR（Quantitative real-time PCR,q RT-PCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot,WB）技术检测假手术组及CUUO组肾组织总RNA的m6A修饰水平、甲基转移酶（METTL3、METTL14、WTAP）、去甲基化酶（ALKHB5和FTO）、EMT特征性指标（E-cadherin、α-SMA和VIMENTIN）的表达;（4）TGF-β1转染TCMK-1细胞后,检测细胞中m6A修饰水平、m6A修饰酶及EMT标志物的表达。2、CUUO-7天肾组织m6A表观转录组信息概况和RNA测序与MeRIP测序的关联分析:（1）选择CUUO组及假手术组7天肾组织进行MeRIP高通量测序,检测具有显著m6A修饰差异的mRNA位点（以Fold-change>1.5为界）及其富集情况,并进行保守基序（motif）、GO和KEGG等分析;（2）采用RNA高通量测序技术,筛选CUUO组及假手术组肾组织中明显差异化表达的转录本,进行聚类、GO和KEGG等富集和通路分析;（3）通过进行RNA测序与MeRIP测序（“差异表达转录本”及“差异m6A修饰水平转录本”）联合分析揭示m6A修饰调控的mRNA;（4）利用q RT-PCR及MeRIP-q PCR实验验证组间差异化表达的mRNA及其m6A修饰水平的变化。3、METTL3调控的m6A修饰变化对TCMK-1细胞活力、细胞凋亡及EMT表型的影响:（1）构建敲减及过表达METTL3慢病毒,分别转染TCMK-1细胞,采用CCK-8、流式细胞术、Western blot等技术检测TCMK-1细胞活力、凋亡、EMT表型及ERK1/2和p ERK1/2的表达;（2）构建敲减LZTR1慢病毒转染TCMK-1细胞,采用CCK-8、Western blot等技术检测TCMK-1细胞活力、ERK1/2和p ERK1/2的表达;（3）MeRIP-q PCR检测过表达METTL3的TCMK-1细胞LZTR1 mRNA的m6A修饰水平。4、统计学分析:实验数据分布用均数±标准差表示,其中每组实验数据至少设置三个生物学重复。使用SPSS 22.0和Graph Pad Prism 8.0软件进行数据处理及分析,采用独立样本t检验和单因素方差分析进行组间差异检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1、CUUO组肾组织肾间质纤维化、m6A修饰水平及相关酶表达的改变（1）随梗阻时间延长,CUUO组肾损伤逐渐加重;肾组织总RNA的m6A修饰水平在术后1周内呈时间依赖性下降,在第7天检测到最低的水平;（2）METTL3和METTL14的下调以及FTO的上调可能是总RNA的m6A修饰水平在特定时间减少的原因;（3）TGF-β1诱导TCMK-1细胞导致α-SMA、VIMENTIN表达上升,E-Ca表达下降;WTAP、FTO表达上升,METTL14表达下降。综上,我们选择CUUO-7天组的肾组织进行MeRIP测序。2、CUUO-7天肾组织RNA测序与MeRIP测序的联合分析结果（1）CUUO-7天组和假手术组的肾组织中所检测的507个基因共鉴定出823个具有显著m6A修饰差异的转录本;在含有单一m6A修饰位点的转录本中,修饰水平上调占54.7%,下调占82.2%;一半以上的m6A修饰位点位于3’UTR区;m6A修饰峰数大于1的转录本的m6A修饰位点主要位于3’UTR区;（2）差异甲基化基因主要与TGF-β信号通路（对于下调的基因）和轴突信号通路（对于上调的基因）显着相关;（3）RNA-seq和MeRIP-seq关联分析显示,在91个基因中有173个m6A修饰峰存在显著差异,甲基化修饰上调的转录本有79个,甲基化修饰下调的转录本有94个。在甲基化修饰上调的79个转录本中,72个转录本表达同步上调,7个反向下调;在甲基化修饰下调的94个转录本中,35个转录本同步下调,59个反向上调。（4）在CUUO-7天肾组织中,TGF-β和WNT通路中甲基化程度显著降低的BAMBI、SMAD7、NKD1和SENP2是相应通路的抑制分子;（5）CUUO-7天肾组织中GADD45g、ENPEP、LZTR1和转录因子ZEB1、SNAI2的mRNA甲基化修饰水平发生了显著变化。3、METTL3调控的m6A修饰作用的体外验证（1）敲减METTL3能促进TCMK-1细胞的增殖活性;过表达METTL3则能促进TCMK-1细胞早期凋亡的发生,抑制增殖活性,促进EMT过程;（2）敲减LZTR1能促进TCMK-1细胞的增殖活性;（3）敲减METTL3、敲减LZTR1均能显著上调p ERK1/2的表达;（4）过表达METTL3后LZTR1 mRNA m6A修饰水平及其mRNA表达显著上升。结论:1、m6A修饰水平的变化与梗阻性肾病肾间质纤维化的严重程度显著相关,其中METTL3、METTL14和FTO表达的改变可能在该疾病相关转录本的m6A修饰的调控中起重要作用。2、特异m6A修饰转录本参与梗阻肾病肾间质纤维化病理过程中,其中大部分富集在TGF-β,WNT,NORCH、MAPK等信号通路上。3、METTL3可通过作为m6A甲基转移酶进而调控TCMK-1细胞的m6A修饰的改变,并介导TCMK-1细胞增殖、凋亡及EMT过程。METTL3可能参与了LZTR1mRNA m6A修饰的调控。METTL3可能通过调控LZTR1 mRNA m6A修饰参与MAPK/ERK1/2信号通路的激活,进而影响TCMK-1细胞增殖活性和EMT过程。