本研究旨在克隆COX-2编码基因的全长cDNA序列，并构建其正、反义真核表达载体。通过基因转染，逆转原先COX-2高表达或低表达的人胃癌细胞系的表达水平，观察其生物学行为及相应信号分子、信号转导途径的变化情况，以初步探讨COX-2表达在胃癌发生中的某些具体机制。主要实验方法及结果包括： 1．由COX-2高表达的胃癌细胞中提取RNA，通过RT-PCR方法，扩增了编码COX-2全长的cDNA序列，经序列测定加以证实。 2．通过定向克隆方法，将目的基因按正反两个方向亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1（+），构建其正、反义真核表达载体pcDNA3.1/hCOX2（+）及pcDNA3.1/hCOX2（-），其方向性由酶切鉴定证实。 3．使用脂质体介导的方法用反义重组载体及空载体分别转染COX-2异常高表达的人胃癌细胞系SGC7901，经G418筛选，得到稳定转染的细胞株7901-AS及7901-P。经免疫细胞化学及RNA斑点杂交试验证实：在反义核酸转染的7901-AS细胞中COX-2的蛋白及mRNA水平均下调。 4．MTT比色试验显示7901-AS细胞的增殖速度低于亲本SGC7901细胞。 5．裸鼠体内成瘤试验表明，三组细胞接种裸鼠30天后，瘤体的平均重量分别为（χ±s）：826.67±77.67（SGC7901细胞）；776.67±300.06（7901-P细胞）；486.67±15.28（7901-AS细胞）。统计学处理表明，转染反义核酸的细胞成瘤性显著低于未转染细胞及转染对照载体细胞。 第四旱巨大学硕士学位论文 6．检测转染前后细胞培养上清中前列腺素 PGEZ水平，分别为：18．2 3士0．85pg／L（SGC7901）；17．97ti．04卜g／L（7901一P）；12．9士0．92卜g／L（7901－AS）。反义核酸转染组与前两组相t匕具有显著差异（p＜0．01）。 7．转染前后细胞中蛋白激酶活性检测提示：每卜g蛋白粗提物总＊＊A与活性PKA活性分别为0．207，0．116pmoVmin（SGC7901）及0．214，0＊24PmoUmin门901－AS）。反义核酸转染细胞中的总 PKA活性与亲本细胞相近，但活性PKA明显低于亲本细胞。 8．电生理学结果显示：SGC7901细胞及反义核酸转染细胞中均存在典型的延迟整流钾电流（Ik）。相同的测试条件下（钳制电压－4 omV，阶跃去极化测试电压从一 80一＋80mV，阶跃升幅为 20mV，刺激时程为 800ms，间歇 Is，刺激频率为0．ZHZ），在每个测试电压下，转染细胞的钾电流均显著低于亲本细胞（p＜0．of）。SGC7901细胞给子COX－2暑制剂消炎痛（hdometh＜cin，10 vM）后，Ik亦显著降低，停药并冲洗后，电流可完全恢复。提示 COX－2表达及活性与细胞延迟整流钾通逾电流具有密切关系。 9．培养的胃癌细胞中加入不同浓度的钾通道抑制剂TEA、4－AP后，观察7天，可见两者对细胞增殖均有抑制作用，且具有剂量依赖性。 以上实验表明：人胃癌细胞系SGC7901中COX－2异常高表达与细胞的恶性生物学行为有关。PGE。yJ k PKA可能参与了 COX－2在胃癌发生中的信号转导过程。COX－2的表达及活性与胞膜延迟整流钾通道的活性有密切关系，其催化产物前列腺素可能通过一种或多种第二信使激活PKA、PKC途径，对该离子通道进行活性调控，进而影响细胞的生物学行为。抑制COX－2NI＆迟整流钾通道活性均可抑制肿瘤细胞的增殖。以上结果对子阐明胃癌的具体发生机制及探讨其有效治疗方法具有潜在意义。