【摘 要】
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研究目的:本研究通过缺氧复氧条件模拟人心脏缺血再灌注损伤建立缺血再灌注体外大鼠细胞模型,观察缺氧复氧后心肌细胞凋亡以及细胞活性变化,并进一步通过脂质体转染干预lncRNA MEG3表达,检测缺氧复氧后心肌细胞凋亡的变化,拟探索lncRNA MEG3在缺血再灌注所致心肌细胞凋亡中的作用。材料与方法:①研究对象:大鼠H9C2细胞株购自上海中科院细胞库,当细胞处于对数生长期时,给予细胞传代、培养进行实验
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研究目的:本研究通过缺氧复氧条件模拟人心脏缺血再灌注损伤建立缺血再灌注体外大鼠细胞模型,观察缺氧复氧后心肌细胞凋亡以及细胞活性变化,并进一步通过脂质体转染干预lncRNA MEG3表达,检测缺氧复氧后心肌细胞凋亡的变化,拟探索lncRNA MEG3在缺血再灌注所致心肌细胞凋亡中的作用。材料与方法:①研究对象:大鼠H9C2细胞株购自上海中科院细胞库,当细胞处于对数生长期时,给予细胞传代、培养进行实验。②建立细胞不同时段的缺氧复氧模型,设置分组:对照组（NC）、缺氧/复氧组（3h/2h、4h/2h、5h/2h）。应用厌氧产气包、低氧密封培养罐及无糖培养基模拟心肌细胞缺氧损伤,对照组给予持续常氧（21%O2,5%CO2）条件模拟复氧培养。应用CCK-8法计算细胞活力抑制率,选取细胞活力抑制率最大时作为缺氧复氧条件进行实验。③siRNA转染与分组:应用RNAi法干扰LncRNAMEG3表达,设空白对照（Control）组、缺氧复氧（H/R）组、转染无义序列siRNA-NC后缺氧复氧（siRNA-NC-HR）组、转染敲低MEG3表达的siRNA-MEG3后缺氧复氧（siRNA-MEG3-HR）组。siRNA转染载体构建:应用不用浓度配比脂质体3000（lipo3000）分对细胞别转染siRNA,选取转染效率最高的浓度配比建立siRNA转染载体。④检测指标:siRNA瞬时转染后24小时-48小时内应用实时荧光定量PCR检测并对比各组MEG3的表达。转染完成后24小时给予缺氧复氧刺激,各组细胞应用CCK-8法分析细胞活力抑制率,并应用流式细胞仪检测对比各组细胞凋亡情况。应用SPSS 22.0对本实验的所有数据进行统计学分析,实验数据采用均数±标准差（X±SD）表示,各组间实验数据采用t检验,取P＜0.05为差异有显著性意义。研究结果:①缺氧复氧对H9C2细胞形态以及细胞活力的影响:在倒置显微镜下对比各组细胞形态,可见缺氧复氧状态下细胞随缺氧复氧时间延长随之明显变形,由常氧状态下的梭形变为多角形,可见部分细胞簇集、漂浮于培养基中。采用CCK-8法检测计算对比,结果示与其他实验组相比较,缺氧5小时复氧2小时后H9C2细胞细胞活力抑制率最高,约86.6%（P＜0.05）,差异具有统计学意义。②RT-qPCR结果示转染siRNA-MEG3后的H9C2细胞中MEG3表达较对照组相比明显降低（P＜0.05）。③CCK-8法检测结果示缺氧复氧（H5h/R2h）刺激后H9C2细胞中细胞活力明显降低,转染siRNA-MEG3可明显降低细胞活力抑制（P＜0.05）。④应用流式细胞仪对比,H/R组细胞凋亡率较常氧组细胞明显升高（P＜0.05）。与H/R组比较,siRNA-MEG3-HR组细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）。siRNA-MEG3-HR组细胞凋亡率较正常培养的H9C2细胞（Control）组无明显相关性（P＞0.05）。结论:1.缺血再灌注（缺氧复氧）抑制H9C2心肌细胞活性且促进其凋亡的发生。2.抑制lncRNA MEG3的表达在H9C2细胞缺氧复氧损伤可有效减少细胞凋亡,为今后进一步心肌缺血再灌注损伤的治疗提供分子机制基础。
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