背景：　　 丙型肝炎病毒(Hepatitis C Virus,HCV)是慢性肝炎的主要诱因之一,在世界范围内威胁着人类的健康。WHO估计全球约有2.2％约1.7亿人感染HCV,60％的感染者将长期携带,而其中的20％可能发展成为肝硬化甚至肝癌。国内流行病学调查显示,我国抗HCV阳性率平均为3.2％,约有4500万感染者。目前对于HCV感染的处理措施依然有限,研究安全有效的丙型肝炎病毒疫苗,仍是目前攻克HCV的关键任务之一。HCV的包膜糖蛋白E1,E2在天然状态下被高度糖化,是构成HCV病毒颗粒表面结构的主要成分,与病毒吸附和进入靶细胞过程有着重要的关系。二者作为病毒的重要组成部分,是最为重要的中和性抗原表位的所在,同时也是发生变异的集中区域,因此被普遍认为是进行HCV疫苗研究的关键靶标[1-4]。　　 脂联素是由白色脂肪组织生成的一种糖蛋白质激素,参与机体的脂糖代谢调节,能够超敏化胰岛素的作用,对于HCV诱发胰岛素抵抗从而引起肝脂肪变性有潜在的抑制作用。脂联素球形结构域(gAD)是脂联素的主要功能区域,其空间结构与TNF-α相似,表达后可形成紧密的同源三聚体及多聚形态。同时由于在体内的两种受体之一AdipoR2在肝脏具有丰富的表达,所以gAD可具备一定的肝靶向性。目前脂联素在机体炎症方面的作用并不明确,已有研究显示其可能具有促进和抑制炎症的双重功效[5-9]。　　 目前采用基因工程进行HCV E1和E2进行体外表达的研究体系仍以原核表达为主,可能由于所生成的蛋白在修饰等方面与病毒自然的宿主细胞存在差异,导致获得经充分修饰的HCV包膜糖蛋白比较困难。采用真核表达体系所面临的主要问题便是产量过低,本研究试图利用信号肽置换增强HCV包膜糖蛋白在真核细胞的表达,而目前相关研究则并不多,其中主要是对E1E2自身的信号区域进行互换或添加[10]。另外,为了研究脂联素在抗原免疫中的作用,根据已有的相关研究,本实验在已构建的表达质粒的基础上加入gAD序列构成系列重组DNA疫苗质粒,通过与原质粒对照获得相关的免疫学数据差异,用以评判gAD在疫苗以及诊断方面应用的可行性。　　 方法：　　 本研究采用pVRC真核表达载体,分别构建了携带HCV中国HeBei株(1b)E1和E2包膜糖蛋白基因去跨膜区的表达质粒及经信号肽置换优化后的表达质粒,将其分别转染入293T细胞,采用Western blot,Dot Blot以及GNA capture EIA等方法证实并分析比较了其表达。在上述实验的基础上,探索性地将脂联素球部蛋白的基因加入载体,构成了两组共八种抗原融合表达质粒,经转染293T细胞后采用Western Blot以及间接免疫荧光等方法进行了基因表达的证实和比较后,选取相应的高效正确表达质粒对小鼠进行了免疫,于0,3,6周采用皮内电转方式注射DNA进行三针免疫,采用ELISPOT和ELISA等手段对免疫所诱发的细胞和体液免疫进行了综合评价。　　 结果：　　 一、HCV E1/E2高效分泌表达质粒的构建与优化.　　 利用PCR方法亚克隆非跨膜区段的HCV中国HeBei株(1b)的E1和E2包膜糖蛋白基因,将其分别插入pVRC载体构建pVRC-HeBei-E1和pVRC-HeBei-E2两种分泌型真核表达质粒。将质粒瞬时转染293T细胞后,经Western blot验证了其在细胞内和胞外均能正确有效表达。经信号肽分析后,设计选取了S-SD,S-FPA,S-Gluc三种信号肽基因将原信号肽基因进行置换,经Western blot证实其均能在293T细胞中获得有效表达,而且从经去糖基化和非还原处理的结果比较来看,信号置换并未引起目的蛋白条带明显的改变。表达样品同时采用了Dot-Blot和GNA capttire EIA方法进行了半定量,经分析比较后认为,S-TPA和S-Gluc信号序列置换的质粒能获得较原始信号肽序列获得更为有效的表达,两者的表达效率相当,其中E1组的结果显示,优化后的目的蛋白表达效率能提高六倍以上。但是,尽管从软件分析的数据上较其余信号肽更有优势,自行设计的S-SD序列却仅获得了优于原始信号肽的表达检测结果。　　 二.表达gAD的基因序列融入对HCV E1/E2 DNA疫苗免疫效果的影响利用重叠PCR将去跨膜区的HCV中国HeBei株(1b)E1和E2基因加入铰链区后,分别与gAD蛋白基因序列进行融合基因构建,插入pVRC载体构建获得pVRC-HeBei-E1-gAD和pVRC-HeBei-E2-gAD两组分泌型真核表达质粒。同时将gAD片段连入已构建的E1/E2信号肽置换质粒中,获得了两组共八种质粒,分别转染293T细胞进行表达分析。经E1,E2,gAD特异性单克隆抗体的检测证实了各自的表达,并发现不同信号序列质粒的表达结果与无gad序列质粒基本一致,即s-Gluc和s-TPA信号肽的置入能使目的蛋白获得更为有效的表达。　　 为了研究gAD序列的融入对目的质粒抗原性的影响,同时观察信号肽置换对免疫效果提升的效果,在前述研究的基础上,实验选取了原始信号肽的E2和E2-gAD质粒以及S-Gluc信号肽的E2-gad质粒进行了小鼠的DNA免疫。采用30μg/只的DNA免疫剂量,经皮内注射加卡钳电极电转的方式于0,3,6周免疫Balb/C小鼠,分次采血采用间接ELISA法检测特异性的体液免疫反应水平,最后取脾细胞进行ELISPOT检测分析其所诱发的E2特异性T细胞免疫应答水平。结果显示,在体液免疫效果方面单纯采用DNA免疫的效果并不理想；而在细胞免疫方面,实验组的ELISPOT计数(均大于50 SFC/106脾细胞)与对照组相比具有明显统计学差异,说明所采用的质粒能有效诱导小鼠针对E2的特异性细胞免疫；含gAD组质粒的免疫效果相对于原始信号肽E2质粒免疫组为优,而信号肽置换后的E2-gAD质粒免疫组所获得的计数提升与单纯E2组相比则存在明显的统计学差异,说明gAD基因的融入可在一定程度上增强疫苗的免疫原性,能够更有效地诱导抗原特异性T细胞反应的产生,并且高效的信号肽的置入可更为有效地体现这一效果。　　 结论：　　 本研究的主要结果和发现可总结为:　　 1.在pVRC载体上成功构建了一系列HCV包膜糖蛋白E1、E2及其分别与脂联素球部蛋白融合的真核表达质粒系统；　　 2.在所构建质粒系统中探索了信号肽置换对目的蛋白表达的影响；　　 3.初步证实了脂联素球部蛋白的融合可在一定程度上增强疫苗的免疫原性。　　 本课题的研究为进行HCV的E1和E2包膜糖蛋白的抗原制备和疫苗研究创建了一个新的平台。通过对目的蛋白进行信号肽置换提升其表达效率,为其在真核表达系统的基础上进行大规模制备提供了一条新的优化途径。同时实验评价了融合脂联素球部蛋白后对疫苗免疫学效价的增强,为发展研究相应的HCV治疗性疫苗进行了理论和技术的储备,也为进一步进行相关的疫苗和诊断试剂的研究和开发奠定了基础。