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目的:将弓形虫棒状体16蛋白在体外表达并将其纯化后,制备兔抗多克隆抗体。构建ROP16真核表达载体并转染入293T细胞,使其成功表达ROP16蛋白,探讨ROP16对293T细胞凋亡的影响。方法:分别构建重组质粒ROP16/p TG19-T和ROP16/p ET32a,并于Rosetta中诱导表达。通过KCl染色切胶法对重组蛋白进行纯化,制备多克隆抗体,并用Western blotting和IFA技术分别对其进行鉴定。构建ROP16真核表达重组质粒p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,并用PCR和双酶切法进行鉴定,提取无内毒素阳性质粒。采用瞬时转染法使得重组蛋白在293T细胞中表达,在三个不同时间点收集标本,用Wenstern blotting和RT-PCR法检测分别定量和定性检测ROP16在293T细胞内的表达。将293T细胞接种于培养板中,待细胞长至60%左右(≤24h),向细胞中转染空载质粒和p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16重组质粒。使用0.5μg/ml Act D诱导凋亡。于转染后24 h、48 h收集标本,分别用于以下实验:将标本用Annexin V-FITC/PI染色以及TUNEL Bright Green试剂盒染色,检测凋亡率。提取标本中RNA并反转录为c DNA,RT-PCR法检测Bcl-2/Bax及Caspase3的变化。结果:成功扩增出ROP16基因片段并构建ROP16原核表达重组质粒。电泳结果显示99.8 k Da处有符合大小的条带。将纯化后重组蛋白免疫家兔并获得多克隆抗体。Western blotting结果显示在74 k Da处有符合大小条带,IFA结果显示目的蛋白的绿色荧光分布在弓形虫速殖子的胞质内,具体位置为细胞核前端。成功构建真核表达重组载体p3XFLAG-Myc-CMV?-24-ROP16,转染293T细胞后三个时间点的样本经Western blotting均能检测出符合大小的条带,根据条带的粗细判断蛋白表达量与时间成正比。数据统计结果显示,转染ROP16的实验组凋亡率均低于对照组,并且在24h、48h两组差别有统计学意义(P<0.05)。转染后24 h、48 h,ROP16转染组Bcl-2/Bax明显高于空载转染组(P<0.05)。ROP16转染组Caspase3与actin比值明显低于空载转染组(P<0.05)。结论:成功构建了原核表达重组质粒ROP16/p ET32a,并制备ROP16兔抗多克隆抗体,对多克隆抗体分别进行定性和定量分析,证明其具有较高的免疫反应活性。ROP16蛋白在宿主细胞中成功表达,并且对宿主细胞凋亡有抑制作用。