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研究背景坏死性小肠结肠炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是新生儿最严重的肠道炎症疾病之一。目前,临床上治疗方式有限,效果欠佳,究其原因可能缺乏针对发病机制以及特异性定点释药的治疗策略。NEC发病过程中促炎因子与抗炎因子失衡,且活性氧(reactive oxygen species,ROS)产生过量,加重肠组织损伤。槲皮素(Quercetin)是一种天然的类黄酮化合物,不仅具有抗炎、抗氧化作用,而且来源广、安全性高,临床价值极高。因此,槲皮素是NEC治疗的潜在有效药物,而槲皮素的疏水性、生物利用度低、清除快等缺点,极大限制了其治疗效果。ROS响应纳米载体可以提高疏水性药物的溶解度,且能够在高水平ROS环境中特异性定点释放药物,提高药物生物利用度,降低毒副作用。NEC病变部位显著增多的活性氧为ROS响应纳米载体的定向释药提供了有利条件。海藻酸水凝胶保护纳米载体抵御胃液破坏,递送药物至结肠,充分发挥口服给药的方便、灵活、安全、依从性高等优势。研究目的1.制备一种负载槲皮素ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin,探讨其表征与性质;海藻酸水凝胶包裹纳米颗粒R-NPQuercetin,观察其在模拟胃肠环境中的释放;2.在细胞水平探讨ROS响应载药纳米颗粒R-NPQuercetin对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)刺激IEC-6细胞的氧化应激、炎症反应、细胞增殖与凋亡的影响;3.在动物模型中探讨口服ROS响应载药纳米颗粒R-NPQuercetin对肠组织损伤修复的作用以及体内安全性评价。研究方法1.ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin表征与性质:(1)采用粒度仪及透射电子显微镜(TEM)检测纳米颗粒R-NPQuercetin尺寸及形貌;(2)使用紫外分光光度计验证R-NPQuercetin对槲皮素的成功包被并计算包封率、载药量;(3)在模拟肠液环境PH=6.8和PH=7.4的PBS溶液检测R-NPQuercetin的稳定性;(4)在含有或不含1 m M H2O2的PBS溶液中,观察纳米颗粒R-NPQuercetin包被的槲皮素释放;在模拟胃液(PH=1.2)和模拟肠液(PH=6.8)检验水凝胶包裹的纳米颗粒R-NPQuercetin中的槲皮素释放。2.ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin体外生物学效应:(1)采用MTT实验检测空R-NP对IEC-6细胞的细胞活力影响;(2)激光共聚焦和流式细胞技术分析LPS刺激的IEC-6细胞对R-NPQuercetin的摄取;(3)实验分为正常组(Control)、损伤组(LPS)、游离药物治疗组(LPS+Free Quercetin)、非响应纳米颗粒治疗组(LPS+NCQuercetin)、ROS响应性纳米颗粒治疗组(LPS+R-NPQuercetin),通过DCFH-DA荧光探针观察细胞内ROS水平,分别用超氧化物歧化酶(SOD)比色法和丙二醛(MDA)比色法检测细胞内SOD、MDA表达水平;(4)ELISA法检测LPS刺激的IEC-6细胞的炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)表达水平,髓过氧化物酶比色法测定MPO含量;(5)采用细胞免疫荧光检测细胞PCNA阳性细胞数和TUNEL染色观察细胞凋亡水平。3.ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin体内生物学效应:(1)新生乳鼠分为正常组(Control)、损伤组(NEC)、游离药物治疗组(NEC+Free Quercetin)、非响应纳米颗粒治疗组(NEC+NCQuercetin)、ROS响应性纳米颗粒治疗组(NEC+R-NPQuercetin)。出生5天,采用人工喂养、缺氧、冷刺激、LPS灌胃的方式构建NEC模型;(2)观察新生乳鼠的活动量、皮下脂肪、便血、体重变化与生存情况等一般情况;肉眼观察肠组织有无胀气、出血等NEC样损伤病理变化;(3)HE染色观察肠组织病理损伤并组织学评分。(4)采用超氧化物歧化酶比色法检测肠组织内SOD表达水平;丙二醛比色法分析肠组织MDA表达水平。(4)通过ELISA检测肠组织炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10)表达水平和髓过氧化物酶比色法测定肠组织MPO含量;(5)免疫组化(PCNA)观察肠组织上皮细胞增殖;TUNEL染色分析肠组织上皮细胞凋亡;(6)采用免疫组织荧光检测肠组织ZO-1、Occludin、Mucin 2、E-Cadherin的表达分布;(7)口服给药后观察新生乳鼠的体重、血常规、血生化检测以及主要器官的HE染色,评价R-NP纳米颗粒的体内生物安全性。研究结果1.ROS响应的纳米颗粒R-NPQuercetin表征与性质:R-NPQuercetin纳米颗粒为球形,形态规则,大小均一,粒径为70 nm左右;槲皮素的吸收波峰发生偏移,R-NPQuercetin在450 nm显示较强的紫外吸收,载药量为6.2±0.65%,包封率为65.90±2.55%;R-NPQuercetin纳米颗粒在PBS溶液,室温条件下储存7d,粒径未发生显著改变;R-NPQuercetin在含有H2O2的溶液中释放速率加快,6 h内随着时间增加药物释放率上升,达到80%以上;而在不含H2O2的溶液中,释放速率缓慢。水凝胶包裹的R-NPQuercetin在模拟胃液环境(PH=1.2)中少量释放,而在模拟肠液环境(PH=6.8)的环境中快速大量释放。2.ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin体外生物学效应:空R-NP浓度在12.5-400 ug/ml之间,细胞活力保持在90%以上。R-NPQuercetin/DID纳米颗粒与IEC-6细胞共孵育,发现IEC-6细胞内有较强的荧光信号,细胞摄取较多。相较于LPS组,LPS+R-NPQuercetin组降低了细胞MDA表达,提高了细胞SOD水平(P<0.0001),且显著减少细胞ROS的生成。LPS+Free Quercetin组、LPS+NCQuercetin组、LPS+R-NPQuercetin组的细胞TNF-α、IL-1β、IL-6水平均明显低于LPS组,IL-10水平显著高于LPS组(P<0.001),其中LPS+R-NPQuercetin组纳米颗粒最为显著。与LPS组相比,LPS+Free Quercetin组、LPS+NCQuercetin组和LPS+R-NPQuercetin组的PCNA阳性细胞数增多,TUNEL阳性细胞数减少,且LPS+R-NPQuercetin组比LPS+Free Quercetin组、LPS+NCQuercetin组PCNA阳性细胞数更多,TUNEL阳性细胞数更少。3.ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin体内生物学效应:在NEC乳鼠动物模型中,R-NPQuercetin改善其活动度、体重、便血、死亡率等一般情况;降低肠组织MDA水平、炎性介质MPO以及促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平,提高肠组织SOD活力和抗炎因子IL-10水平。此外,R-NPQuercetin增加肠组织中PCNA阳性细胞数,减少TUNEL阳性细胞数目;提高ZO-1、E-cadherin、Occludin、MUC2的表达。口服给药,R-NP和正常组新生乳鼠的体重、血常规、血生化检测以及主要器官的HE染色无明显差异。研究结论1.成功制备负载槲皮素的ROS响应纳米颗粒R-NPQuercetin,具有良好的稳定性,较高的包封率、载药量,较好的ROS响应性释放特性;海藻酸水凝胶能够辅助纳米颗粒R-NPQuercetin避免胃液破坏,且在肠道中大量释放。2.基于LPS刺激IEC-6细胞的体外损伤模型,R-NPQuercetin减轻细胞氧化应激、炎症反应,促进细胞增殖与抑制细胞凋亡,修复细胞损伤。3.NEC动物模型中,R-NPQuercetin缓解了肠组织氧化应激,降低肠组织炎性因子表达与炎性细胞浸润,促进肠上皮细胞增殖与抑制细胞凋亡,改善肠组织屏障功能,修复肠黏膜损伤。口服给药,R-NP具有良好的生物安全性,有望为NEC的临床治疗提供新的策略。