研究背景黄斑是人视觉最关键、最敏锐的部位,多种原因均可以导致黄斑部病变,如光损伤、炎症、外伤、变性、肿瘤等等,常可致不可逆转的视功能障碍。如：老年性黄斑病变(Age-related macular degeneration, AMD)、病理性近视(pathological myopia, PM)、息肉样脉络膜血管病变(polypoidal choroidal vasculopathy, PCV)和特发性脉络膜新生血管(idiopathic choroidal neovascularization, ICNV)等等,这些疾病引起眼底改变的病理基础就是脉络膜新生血管(Choroidal neovascularization, CNV)的生成,若不加以干预治疗,最终发展均会导致严重的视功能的损害,致盲率很高。黄斑部发生变性时,脉络膜毛细血管层-Bruch’s膜-视网膜色素上皮(RPE)以及视网膜外层的神经细胞均发生变性,直接导致视网膜组织细胞慢性缺氧、缺血而致使细胞变性、萎缩等,并使视网膜色素上皮、脉络膜毛细血管基底膜以及Bruch’s膜发生萎缩或增殖。由于脉络膜微血管发生了病变,破坏了RPE的屏障功能和吞噬功能,从而破坏了对视网膜内层感光细胞的保护作用,严重影响视功能。黄斑变性的主要眼底表现为色素脱落或色素增殖、硬性及软性玻璃膜疣(drusen)、渗出、水肿、出血以及最终脉络膜新生血管的形成(CNV)。在关于触发CNV的众多机制中,主要有血管内皮生长因子(vascular enthothelial growth factor, VEGF)、血管生成素(angiopoietin, Ang)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)及粘附因子(adhesionmolecule, AM)等等,其中血管内皮生长因子与抗血管生成因子(anti-angiogenesis factors)之间的失衡尤为重要。VEGF是一种分泌性蛋白质,它可以增加血管通透性,引发炎症,诱发新生毛细血管生成。VEGF广泛分布于人和动物体内的多种组织结构中,如大脑、肝脏、肾脏及眼部等等,其中在眼部视网膜毛细血管的周细胞、视网膜色素上皮细胞和视网膜内皮细胞均存在VEGF,这对维持眼部血管完整性起了重要作用。在正常情况下,眼部组织中VEGF蛋白或VEGF蛋白的mRNA的表达水平很低,但是在缺血、缺氧、炎症等应激情况下,VEGF的蛋白与mRNA的表达水平均会明显增高,从而诱导病态的新生血管的形成。大量实验研究证实,在机体组织新生血管的发生、发展过程中,VEGF起主要作用,VEGF的过度表达会促进新生血管的形成。因此,众多的学者在研究针对黄斑部CNV的治疗药物时,都不约而同的将VEGF作为潜在的治疗目标,比如以VEGF适配子形式出现的哌格太尼(Pegaptanib)或者以抗VEGF抗体片段形式出现的兰尼单抗(Ranibiumab)等。当前,针对VEGF的抑制剂,主要有以下这些：Pegaptanib、Ranibiumab、Bevacizumab、VEGF-trap、KH902等,虽然这些药物对眼部的新生血管有显著的抑制效果,然而这些治疗方法也存在一些不可忽视的问题,主要体现在以下两点：首先由于病灶处局部微环境的病理变化导致VEGF持续分泌,而以上药物玻璃体腔注射后不能长期在患部存在,即使应用了各种药物缓释技术,仍无法达到长期抑制VEGF的需求：更为重要的是这些药物与VEGF结合属于抗原抗体反应,则必然有抗原抗体复合物的生成,由于这些复合物的代谢较为困难,可能存在加重drusen的危险。所以我们认为,抗VEGF药物的作用主要在于局部中和病灶处产生的VEGF,而不能抑制病灶处VEGF因子的继续生成,因而无法避免CNV的复发,理论上来说,抑制VEGF的产生将比降解它更有利于CNV的治疗。当前针对CNV的治疗,除了上述的抗VEGF药物,另一经典有效的治疗方法就是光动力疗法(photodynamic therapy, PDT),维替泊芬-PDT于2000年正式被美国FDA批准用于治疗黄斑区的CNV,此种方法是采取静脉内注射光敏剂-维替泊芬,而后其与血管内低密度脂蛋白相结合,聚集在眼部病灶新生血管处,再用一种特定波长的激光照射眼底病灶,照射范围稍大于眼底血管造影检查所确定的新生血管范围,光敏剂受激光激发后可以把能量传递给周围的氧,生成强活性的单态氧,单态氧和相邻的生物大分子发生氧化反应,产生自由基等细胞毒性物质,并直接作用于CNV使之破坏,并促使局部微血栓的形成,从而使病灶处新生血管发生闭塞,最终导致新生血管萎缩。PDT可以有效的封闭视网膜脉络膜的新生血管,虽对正常的视网膜组织基本没有损伤,但可造成局部组织缺氧；PDT疗法也有其局限性,只能封闭已经形成的新生血管,且病灶区治疗后有可能产生瘢痕。尽管PDT为CNV的治疗提供了一个新的思路,然而同抗VEGF药物一样,也存在病变区CNV的复发问题。因此,治疗并预防黄斑区CNV恶性发展的关键在于有针对性的降低VEGF的产生,从而抑制CNV的形成,以及改善视网膜和脉络膜的微循环。随着对眼部的新生血管相关因子的深入研究,基因治疗成为目前较具潜力的眼部新生血管性疾病的治疗对策,尤其是近10年来兴起的核糖核酸干扰(RNA interference, RNAi)技术,不但为研究生物体的基因表达和调控等功能提供了新方法,同时也为眼部新生血管性疾病的研究、预防与治疗开辟了新途径、新领域。在基因治疗方面,RNAi是沉默特定基因的强有力工具,被广泛应用于各个研究领域。RNAi由一种小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)听介导,是引起生物细胞内特异同源靶基因转录后沉默的基因表达调控机制,普遍存在于各种生物体内。siRNA由21-23个核苷酸组成,为RNaseⅢ裂解外源或内源性长的双链RNA(double-stranded RNA, dsRNAs)分子所形成。在眼部新生血管性疾病的治疗研究方面,以VEGF及其受体VEGFR为靶基因,对体外合成的siRNA或dsRNA进行,结果显示,相应的siRNA可明显降低VEGF或VEGFR的表达水平,减轻VEGF对新生血管形成的诱导作用,抑制眼部新生血管形成,但体外方法无法大量合成siRNA或dsRNA,而且siRNA不稳定、细胞通透性差、需反复使用,使其应用受到极大限制,无法普及应用。目前,激光诱导大鼠CNV模型是我们最常用的方法之一,而CNV制模成功的关键在于Bruch’s膜的破裂：CNV是脉络膜的新生血管通过破损的Bruch’s膜生长入视网膜神经上皮层下,因此如果激光能量过低而不能击穿Bruch’s膜,或激光时功率过大,导致视网膜组织破坏而瘢痕化,都不能形成有效的CNV模型。目前通常是根据操作者的经验(观察激光斑有无出血、气泡等)来判断Bruch’s膜是否被击穿,因此CNV模型成功率都不高。3D-OCT(光学相干断层扫描)问世以来,为视网膜的疾病提供了一种全新的诊断指标,快速无创,且可清晰显示包括Bruch’s膜在内视网膜横断面各层结构,与传统的时域OCT相比,频域OCT具有高分辨率成像和实时动态的优点,还能清楚的反映出CNV与视网膜神经上皮层及视网膜色素上皮层之间的结构关联。可否利用3D-OCT直视下引导激光诱导色素大鼠CNV模型,从而相比于传统肉眼下CNV造模,显著提高CNV模型制备的成功率呢?本研究拟采用Long-Evans色素大鼠,以其VEGF的mRNA调控区为靶基因,构建能表达作用于调控区的长发夹dsRNA(long-hairpin RNA,1hRNA)的质粒,并注射至正常色素大鼠玻璃体腔内,然后对接受质粒注射的大鼠进行3D-OCT引导下激光诱导CNV,研究VEGF mRNA干扰质粒对CNV形成的抑制作用。研究玻璃体腔注射质粒后,能否在大鼠体内表达形成特异性的1hRNA,并观察此质粒对大鼠CNV的形成是否有抑制作用,期望通过沉默VEGF-mRNA的调控区来降低VEGF的产生,同时破坏mRNA的稳定性,达到抑制眼部新生血管形成的作用。该方法能克服体外合成siRNA的诸多不足,为治疗应用提供实验与理论依据。同时,将为眼部新生血管性疾病的治疗开辟新途径,提供新思路和新方法。本课题从以下三个方面进行研究后得到如下结果和结论：第一部分：VEGF基因RNA干扰质粒的构建与鉴定目的构建干扰大鼠血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)基因RNA表达的重组质粒,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定基础。方法以Long-Evans大鼠VEGF为靶基因,以pcDNA3.1为质粒载体,设计3组针对VEGF基因的RNA干扰(RNA interference,RNAi)序列,应用基因重组技术克隆入载体pcDNA3.1中,重组质粒分别命名为pcDNA3.1-VEGF-LH1、 pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,并用DNA直接测序法和双酶切法鉴定构建的重组质粒。结果DNA测序证实克隆入载体pcDNA3.1(-)中的序列正确,双酶切、PCR结果显示有目的片段的释放,证实RNA干扰序列正确插入载体pcDNA3.1(-)。结论成功构建针对VEGF基因的RNAi质粒pcDNA3.1-VEGF-LHl. pcDNA3.1-VEGF-LH2和pcDNA3.1-VEGF-LH3,为进一步研究该RNAi质粒在脉络膜新生血管形成中的作用奠定了基础。第二部分：3D-OCT可视引导激光诱导色素大鼠CNV模型目的在3D-OCT可视引导下,采用氪红激光诱导色素大鼠脉络膜新生血管(CNV)模型,观察大鼠CNV模型成功效率。方法24只Long-Evans大鼠随机分2组,每组12只。均选取右眼为实验眼,进行氪红激光诱导大鼠CNV:A组为对照组,非3D-OCT引导；B组为实验组,即在3D-OCT可视引导下行激光诱导大鼠CNV模型。A组在视乳头周围I-2PD处予氪激光8点,激光时肉眼观察到有气泡产生或少量出血。B组在眼底激光光凝的同时,以3D-OCT同步扫描,选择Bruch’s膜被击穿处光凝斑8点。光凝3周后行眼底照相、眼底血管造影检查及3D-OCT检查,比较两组大鼠CNV模型的成功率。结果光凝后3周,观察到A、B两组视网膜水肿均基本消退,可见灰白色激光斑、少数出血斑周围见黄白色渗出物,荧光素渗漏。其中A组可见57点出现Bruch’s膜破裂、38点出现CNV,B组96点激光斑Bruch’s膜均破裂、73点出现CNV。χ2检验两组有显著性差异(P<0.05)。Bruch’s膜破裂与CNV出现率呈高度正相关,相关系数r=0.64。结论成功诱导CNV模型的关键是Bruch’s膜的破坏,3D-OCT直视下引导氪激光诱导为实验性CNV模型能提高模型的成功率,也为进一步研究RNA干扰质粒在色素大鼠脉络膜新生血管(CNV)形成中的作用奠定基础。第三部分：PNA干扰质粒对激光诱导色素大鼠CNV形成的抑制作用目的验证RNA干扰质粒对激光诱导大鼠脉络膜新生血管(CNV)的形成是否有抑制作用。方法24只Long-Evans大鼠随机分2组,每组12只。均选取右眼为实验眼,A组为空白对照组,在3D-OCT引导下行氪激光诱导CNV; B组为实验组,右眼玻璃体腔注射RNA干扰质粒后,在3D-OCT引导下行氪激光诱导CNV。在视乳头周围1-2PD处予氪激光光凝,激光同时3D-OCT同步扫描,选择Bruch’s膜被击穿处光凝斑8点。光凝3周后行眼底照相、3D-OCT及眼底血管造影检查,比较两组大鼠CNV模型的成功率。结果3周后,A组全部96点激光斑均出现Bruch’s膜破裂、68点出现CNV, B组96点Bruch’s膜破裂、19点出现CNV。χ2检验两组有显著性差异(P<0.05)。结论玻璃体腔注射RNA干扰质粒能够有效的预防动物模型CNV的形成。