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目的:自噬抑制可促进多囊肾疾病的发生发展,因此本研究通过体外实验观察苦参碱对小鼠肾脏内髓集合管上皮细胞(IMCD3)自噬的影响,以探讨苦参碱诱导细胞自噬的相关分子机制。由于目前该疾病领域内缺少公认理想的动物研究模型,本实验首先利用CRISPR/Cas9结合Cre-lox P技术建立条件性Pkd1基因敲除小鼠模型,初步探索Pkd1基因在成体小鼠肾脏内部的功能,从而为下一步苦参碱干预多囊肾动物模型以及发现新的多囊肾基因治疗靶点提供实验参考依据。方法:1.苦参碱对IMCD3细胞自噬的影响首先使用CCK-8实验方法检测在不同的苦参碱给药浓度下,IMCD3细胞活性有何变化;通过Annexin V-FITC染色法观察在药物浓度变化情况下对IMCD3细胞凋亡的影响;Western Blot法检测给药后细胞内部自噬标记物LC3-Ⅱ蛋白的表达水平;使用免疫荧光染色法观察在给药干预后IMCD3细胞内LC3-Ⅱ的荧光强弱情况;通过透射电镜观察苦参碱给药后细胞内部自噬小泡的变化;随后Western Blot法检测在不同给药浓度下IMCD3细胞内p-ERK、ERK、Beclin-1、p53、p-p70S6K、p70S6K、p-Akt、Akt等与自噬相关的蛋白表达情况。2.Pkd1条件性基因敲除小鼠肾功能减退的动物模型研究利用CRISPR/Cas9结合Cre-lox P系统构建基因型为Pkd1flox/flox的F0代基因敲除小鼠,并将其与野生型小鼠杂交,后代筛选得到基因型为Pkd1flox/+的F1代杂合子小鼠;并且使相同基因型的F1代小鼠内部繁殖,获得具有Pkd1flox/flox基因型的F2代纯合子小鼠;再将其与具有Cre阳性表达的Ggt1-Cre小鼠进行杂交,从而获得基因型为Pkd1flox/+Ggt1Cre的F3代小鼠;后将F3代小鼠进行内部繁殖或者与F2代小鼠杂交,最终筛选出具有Pkd1flox/floxGgt1Cre基因型的F4代小鼠(即Ggt1-c KO小鼠);基因敲除小鼠繁育全过程均使用PCR技术对小鼠后代进行基因型鉴别及筛选。按最终基因鉴定结果将小鼠分为三组:由野生型小鼠组成的WT对照组、由基因型为Pkd1flox/flox纯合子小鼠组成的PKD对照组、由基因型为Pkd1flox/floxGgt1Cre的基因敲除小鼠组成CKO验证组。实验使用PCR技术检测各组小鼠肾脏髓质组织的Pkd1基因敲除情况;随后检测Ggt1-c KO小鼠体内肾脏、小肠、脾脏、肝脏、心脏各组织的Pkd1基因敲除情况;RT-q PCR技术检测各组小鼠肾脏髓质内部Pkd1基因的m RNA表达情况;对各组小鼠肾脏进行H&E染色并观察其病理组织情况;通过测量各组小鼠的体质量与肾脏重量对各组小鼠的肾脏系数(肾脏系数=肾脏质量/体质量)进行计算;通过血液生化检测技术观察各组小鼠血清中的肾功能指标尿素氮(BUN)、血肌酐(CREA)的含量变化情况。结果:1.苦参碱对IMCD3细胞自噬的影响在以浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL、0.8 mg/mL、1.6 mg/mL的苦参碱干预细胞后,与对照组相比,细胞活性在药物浓度为1.6 mg/mL时明显下降(P<0.01);在与对照组的结果相比,Annexin染色法检测结果显示细胞凋亡率在苦参碱浓度为1.6 mg/mL时显著增加(P<0.05),其余浓度则无明显变化;通过Western Blot法检测苦参碱对自噬相关标志蛋白LC3的表达影响,结果显示IMCD3细胞内部的LC3蛋白表达可随着给药时间或给药浓度的增加而增强;以浓度为0.8 mg/mL的苦参碱干预细胞后,其细胞内部LC3-Ⅱ蛋白表达与阳性药物组(雷帕霉素)的结果呈现相同上升趋势;免疫荧光染色法检测LC3-Ⅱ蛋白的结果显示,在药物浓度为0.8 mg/mL的苦参碱处理组中该细胞胞质内LC3-Ⅱ的荧光强度明显增强;在浓度分别为0.4 mg/mL、0.8 mg/mL的苦参碱药物干预下,与空白对照组的结果相比,IMCD3细胞内部自噬小泡数量随着药物浓度的升高而增加;使用药物浓度分别为0.2 mg/mL、0.4 mg/mL和0.8 mg/mL的苦参碱处理细胞24小时后,Western Blot结果显示IMCD3细胞内p70S6K、Beclin-1、p53、ERK、p-Akt、Akt等相关蛋白表达未见明显改变,而p-P70S6K与p-ERK的表达则明显降低。2.条件性Pkd1基因敲除小鼠肾功能减退的动物模型研究经四代繁育以及PCR基因鉴定技术筛选后,获得基因型为Pkd1flox/floxGgt1Cre的条件性基因敲除小鼠;与WT、PKD组相比,RT-q PCR检测结果显示CKO组小鼠肾脏内部中Pkd1基因的m RNA表达明显下调(P<0.05);PCR检测结果表明,该小鼠肾脏组织内部的Pkd1基因被敲除并且具有肾脏特异性;小鼠肾脏组织的表型及H&E染色结果显示,CKO组小鼠的肾脏皮质与髓质内部充满大小形态不一的囊肿,各囊肿间存在少量完整的肾脏结构,出现肾小球硬化、肾小管萎缩、肾间质纤维化等病理现象,而WT、PKD组小鼠的肾脏均无明显异常;CKO组小鼠的肾脏系数与PKD、WT组的结果相比都有显著增加(P<0.01),而在其余组间比较则无差异;血液生化检测结果显示,CKO组小鼠血清内的BUN、CREA含量明显高于WT组以及PKD组小鼠(P<0.01)。结论:1.当苦参碱浓度低于1.6 mg/mL时对IMCD3细胞的活性与凋亡并无明显影响。除了促进细胞自噬小泡的形成来诱导自噬以外,苦参碱可通过ERK以及p70S6K的磷酸化起到参与IMCD3细胞自噬的作用,并且具有一定的浓度依赖性。随着给药浓度的增加,该药物对细胞自噬的诱导作用进一步增强,表明苦参碱可以通过诱导细胞自噬从而参与PKD的研究治疗过程。2.小鼠肾脏内部的Pkd1基因敲除后可出现肾小球滤过率下降以及肾脏内部多个囊泡进行性生长等表现,符合多囊肾疾病的肾脏病理学特征。表明CRISPR/Cas9结合Cre-lox P技术可以建立条件性Pkd1基因敲除小鼠模型,并且Pkd1基因的缺失将对其肾脏的正常功能造成影响。