【摘 要】
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为探究野生型枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B2的定殖状态及在烟株根围土壤中的微生态效应。本研究以菌株B2为材料,分别采用绿色荧光蛋白基因GFP标记构成工程菌株B2-GFP,采用DAPI荧光分子染料染色处理构成菌株B2-DAPI,并测定工程菌株B2-GFP和菌株B2-DAPI的生物活性和稳定性;采用抗生素平板涂布法探究了两菌株在烟株根际根围土壤中以及烟株体内的定殖动态;最后利用宏
【基金项目】
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河南省洛阳市烟草公司科技项目（LYKJ202109）；
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为探究野生型枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）B2的定殖状态及在烟株根围土壤中的微生态效应。本研究以菌株B2为材料,分别采用绿色荧光蛋白基因GFP标记构成工程菌株B2-GFP,采用DAPI荧光分子染料染色处理构成菌株B2-DAPI,并测定工程菌株B2-GFP和菌株B2-DAPI的生物活性和稳定性;采用抗生素平板涂布法探究了两菌株在烟株根际根围土壤中以及烟株体内的定殖动态;最后利用宏基因组全基因组测序技术分析了菌株B2对烟株根围土壤微生态的影响。主要结论如下。（1）工程菌株B2-GFP和菌株B2-DAPI均可在荧光显微镜下观察到荧光菌体,菌株B2-GFP、菌株B2-DAPI和菌株B2的生长动力曲线结果显示菌株B2-GFP较野生型菌株B2提前1 h进入指数增长期,在第11 h同时进入稳定生长期,菌株B2-DAPI与菌株B2同时进入指数增长期,变化趋势一致,但生物量一直低于菌株B2。平板对峙培养法测定工程菌株B2-GFP与B2-DAPI对烟草疫霉的抑菌率为48.30%与48.95%。（2）盆栽土壤定殖试验结果表明:（1）在灭菌土壤中,第14 d两种标记菌株在烟株根际土壤活菌数达整个取样期的最大值,菌株B2-DAPI与B2-GFP的最大值为2.00×10~7CFU/g与1.61×10~7CFU/g;两菌株在烟株根围土壤的活菌数增殖状态也相同,但第42 d菌株B2-DAPI的最大峰值8.17×10~6CFU/g大于菌株B2-GFP最大峰值3.92×10~6CFU/g;（2）在自然土中两种标记菌株在根际根围土壤的活菌数的变化规律一致,根际土中菌株B2-DAPI的活菌数在第42 d达到最大值1.87×10~7CFU/g,大于菌株B2-GFP的最大值1.46×10~7CFU/g。（3）菌株在烟株体内定殖试验结果表明:通过荧光显微镜观察以及DNA测序比对证明烟株体内存在菌株B2,在灭菌土中烟株根、茎、叶内菌株B2-GFP和菌株B2-DAPI的活菌数均先上升后下降,分别在第28 d、第14 d、第28 d达到最大值;自然土中烟株根内菌株B2-GFP的活菌数下降后茎内活菌数上升,茎内活菌数下降后叶内活菌数上升,自然土中菌株B2-DAPI在烟株根内活菌数先上升后下降,第28 d达到最大峰值1.19×10~6CFU/g,茎叶活菌数变化较为缓平,分别在第14 d,第28 d达到最大值分别为2.53×10~5CFU/g,2.03×10~5CFU/g。（4）灌根70 d后试验组和对照组在细菌域的相对分丰度均达到在99.717%以上,但试验组病毒丰度远低于对照组;试验组在厚壁菌门、放线菌门、芽单胞菌门、酸杆菌门、绿弯菌门、拟杆菌门物种丰度大于对照组,在变形菌门的物种丰度显著低于对照组。投入枯草芽孢杆菌B2后可以促进土壤内微生物的抗生素外排,抑制抗生素靶点的改变,增强对抗生素靶点的保护使抗生素的功能更加稳定。自然土壤的试验组和对照组土壤微生物群落结构相似;灭菌土壤栽培的试验组试验组与对照组之间生物种群结构存在显著差异。本研究采用绿色荧光蛋白标记与DAPI荧光分子染料技术构建了工程菌株B2-GFP与B2-DAPI,采用传统植物病理学方法与现代植物病理学手段探究了标记菌株在烟株根围土壤与烟株体内的定殖状态及其对烟株根围土壤的微生态效应,在细胞生物学与分子生物学水平上揭示了菌株B2的生防潜力,为进一步研究其抑菌机理及工程化应用提供了理论依据。
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