目的：柠檬酸杆菌是一类不可忽视的能引起动物感染性疾病的条件致病菌，但是截止到目前为止，对于非人源柠檬酸杆菌的耐药性研究，尤其是对其氟苯尼考耐药机制的相关报道却并不多见。因此本研究旨在通过检测分离自动物及相关环境的柠檬酸杆菌对常用抗菌药物的敏感性及其携带的氟苯尼考耐药基因，结合对一株多重耐药兔源弗氏柠檬酸杆菌R47进行的全基因组分析，从分子流行病学及基因组学的角度共同为非人源柠檬酸杆菌的耐药机制研究提供实验依据和理论基础。
　　方法：1.采集2016-2017年间浙江温州地区三个养殖场内的新鲜动物标本（鸡、鸭、鹅、牛、兔的粪便及鱼类的肠道）和周围环境标本（土壤、池水及污水），进行细菌的分离纯化和菌株信息记录，并妥善保存菌株。
　　2.采用生化反应和16S rRNA测序鉴定出分离菌株中的所有柠檬酸杆菌。
　　3.采用琼脂稀释法测定分离得到的所有柠檬酸杆菌对19种抗菌药物的敏感性，分析两种不同来源柠檬酸杆菌之间耐药情况的异同点。
　　4.采用PCR扩增筛查所有柠檬酸杆菌中的氟苯尼考耐药基因（floR、fexA、fexB、pexA、optrA、cfr和estDL136），了解两种不同来源柠檬酸杆菌中氟苯尼考耐药基因的分布情况。
　　5.提取弗氏柠檬酸杆菌R47基因组进行全基因组测序，随后利用生物信息学技术将二、三代测序结果组装成完整的基因组序列并进行ORFs的预测和功能注释。
　　6.选择合适载体对弗氏柠檬酸杆菌R47基因组上预测的耐药基因进行基因克隆，随后采用琼脂稀释法测定重组菌株的MIC以验证预测基因的功能。
　　7.采用滤膜法进行质粒接合转移实验，检测弗氏柠檬酸杆菌R47携带的耐药质粒的接合转移能力。
　　8.对弗氏柠檬酸杆菌R47携带的两个耐药质粒pR47-54和pR47-309进行比较基因组学分析。
　　结果：1.本研究共分离培养得到405株细菌，经生化反应和16S rRNA测序鉴定出25株柠檬酸杆菌，其中动物来源的有20株，大部分分离自鱼类（80%，16/20）；环境来源的仅有5株。所有柠檬酸杆菌由4个菌种组成，包括弗氏柠檬酸杆菌(18株)、鼠类柠檬酸杆菌(4株)、法默氏柠檬酸杆菌(2株)及吉伦氏柠檬酸杆菌(1株)。
　　2.20株动物源柠檬酸杆菌的耐药性检测结果显示，它们对氨苄西林（100%）、四环素（75%）、链霉素（65%）、氟苯尼考（60%）、氯霉素（60%）和氨曲南（50%）等抗生素表现出一定程度的耐药性，而分离自环境标本的柠檬酸杆菌仅对少数几种抗生素具有抗性。
　　3.氟苯尼考耐药基因的PCR筛查结果显示共在12株动物源柠檬酸杆菌中检测到floR基因，且分离株对氟苯尼考的MIC均≥256μg/ml。其余氟苯尼考耐药基因在所有菌株中均未检测到。
　　4.全基因组测序结果显示弗氏柠檬酸杆菌R47基因组由一个环状染色体和两个环状耐药质粒pR47-54、pR47-309组成，大小分别为4.95Mb、54kb和309kb。ORFs功能注释结果表明R47共编码31个耐药基因，其中floR基因位于质粒pR47-54基因组上。
　　5.药物敏感性实验结果显示与对照菌株相比，本研究中进行功能验证的耐药基因均能使重组菌株对相应抗生素的MIC提高2个及以上稀释度（除qnrB4和qnrB6外）。
　　6.接合转移实验结果显示弗氏柠檬酸杆菌R47携带的两个耐药性质粒均不具备接合转移能力。
　　7.质粒基因组序列比较基因组学分析显示，pR47-54质粒携带的floR基因位于一个不完整的转座子样结构中，且该结构在动物源和人源细菌的染色体和质粒基因组中均有出现。此外，质粒pR47-54和pR47-309基因组上编码的一系列耐药基因与重金属抗性基因与可移动遗传元件有关。
　　结论：1.动物和环境来源的柠檬酸杆菌在抗生素耐药谱及氟苯尼考耐药基因的分布上均具有显著差异，且分离自前者的大多数柠檬酸杆菌存在多重耐药现象。
　　2.动物源柠檬酸杆菌对氟苯尼考产生耐药性的主要机制是其携带的floR基因，并且floR基因可以通过水平转移在不同来源、不同种属细菌间进行传播。
　　3.本文首次报道了兔源弗氏柠檬酸杆菌的完整基因组序列，通过分析弗氏柠檬酸杆菌R47携带的抗性基因与可移动遗传元件间的关系，可推测出在金属和抗生素选择性压力下，这些相关抗性基因可能通过水平转移在不同细菌间广泛传播。