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光学纯的2-羟酸是合成医药和精细化工品的关键中间体。本文通过构建包含(S)-2-羟酸脱氢酶((S)-2-HADH)、羰基还原酶(KAR)和葡萄糖脱氢酶(GDH)的双质粒三酶共表达工程菌,建立了高效的去消旋2-羟酸获得光学纯2-羟酸的多酶级联体系。反应分两步进行,首先外消旋2-羟酸中的(S)-2-羟酸被对映体选择性的(S)-2-HADH氧化为潜手性的酮酸,紧接着潜手性的酮酸被具有立体选择性的KAR还原成(R)-2-羟酸,GDH通过氧化辅助底物葡萄糖实现辅因子NADH循环再生。首先,克隆了Pseudomonas aeruginosa CCTCC M 2011394中的(S)-2-HADH基因,实验结果表明酶活较低。通过基因挖掘筛选到四条(S)-2-HADH序列,选取了P.aeruginosa strain NUST中的高相对酶活和高收率的(S)-2-HADH基因,构建了E.coli BL21(DE3)/pET28bHADH。利用实验室已经构建一株能不对称还原手性酮酸为光学纯产物的共表达菌E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-KAR-GDH,通过双质粒多酶共表达,构建了三酶共表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28bHADH/pCDFDuet-KAR-GDH,建立了高效、高立体选择性去消旋2-羟酸的级联体系。其次,使用基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-HADH和E.coli BL21(DE3)/pCDFDuet-KAR-GDH建立了双菌串联氧化还原级联去消旋体系。对19种底物进行研究,结果表明,19种底物中的绝大多数(1a-1m),经过2-6 h的反应,(R)-对映体的收率大于90%,e.e值大于99.9%,实现了三酶级联把外消旋2-羟酸转化为(R)-2-羟酸。然后,使用基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-HADH/pCDFDuet-KAR-GDH建立了单菌双质粒三酶串联氧化还原级联去消旋体系。反应条件:温度35?C,pH 7.5,菌体浓度8 g DCW/L,底物浓度20 mM。同样对19种底物进行研究,结果表明和使用双菌建立的氧化还原级联反应相比,单菌双质粒三酶氧化还原级联去消旋体系明显缩短了反应时间,大多数2-羟酸(1a-1c,1e-1m),经过2 h的反应,(R)-2-羟酸的收率达到92.7-98.5%,e.e值大于99%。单菌双质粒三酶级联体系不仅避免多菌体的培养,降低菌体总浓度,简化反应过程,而且还明显提高了催化效率,更适合级联催化体系的工业应用。最后,建立了使用E.coli BL21(DE3)/pET28b-HADH/pCDFDuetKAR-GDH三酶共表达级联去消旋体系去消旋邻氯扁桃酸的方法。实验结果表明,在催化邻氯扁桃酸时,最佳的催化条件为温度35?C,最适pH 7.5,菌体浓度8 g DCW/L,葡萄糖的浓度:邻氯扁桃酸的浓度比为1.5:1。考察了在20 mM、50 mM、100 mM、200 mM底物浓度下去消旋邻氯扁桃酸反应进程。氧化-还原级联体系在底物浓度为20-100 mM时,外消旋的邻氯扁桃酸都能完全转化为(R)-邻氯扁桃酸。