手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是一种广泛流行于亚太平洋地区，主要感染五岁以下儿童的传染病。柯萨奇病毒A6型(CoxsackievirusA6，CA6)是该病的主要致病原之一，近几年有关该病毒感染儿童以及成人的报道不断增多。然而，目前还没有针对该病毒的可用疫苗。因此，本研究以开发针对CA6的有效疫苗为目的，重点开展了以下两部分工作:(1)制备针对CA6病毒衣壳亚单位蛋白的特异性多克隆抗体，建立CA6病毒定性和定量分析方法;(2)CA6病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)疫苗的重组表达，免疫原性鉴定以及保护效果的评价。　　在第一部分工作中，首先在小鼠体内扩增CA6病毒，抽提RNA并通过反转录获得cDNA，并以该cDNA为模板分别扩增出CA6病毒衣壳亚单位蛋白VP0，VP1和VP3的基因，插入到原核表达（大肠杆菌表达）载体pET28b(+)，进行原核表达和纯化，获得相应的重组衣壳亚单位蛋白。利用该蛋白免疫动物，收获高滴度的特异性多克隆抗体血清用于CA6病毒的鉴定研究。通过Western Blot和ELISA鉴定分析，最终确定CA6病毒颗粒的衣壳亚单位蛋白由VP0，VP1和VP3或VP0，VP2，VP1和VP3组成，蔗糖密度梯度离心也直观地显示出CA6的这些衣壳蛋白组成病毒颗粒。然后，以纯化的重组蛋白CA6-VP0作为标准品，以制备的anti-CA6-VP0多克隆抗体为检测抗体，建立了CA6病毒的Western Blot灰度定量方法，并成功测定了该病毒储备库中CA6病毒的浓度含量。其次，我们用该病毒感染7日龄小鼠，观察临床症状并确定致死剂量，然后利用苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin Staining)，免疫荧光染色法(Immunofluorescent Staining)以及实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测技术，进一步分析了CA6病毒在感染小鼠体内各重要组织器官中的分布及造成的组织病变情况，并以CA6-VP1为标准品，采用绝对定量检测确定了感染小鼠四肢肌肉组织中的病毒载量。该部分工作成功研制出针对CA6病毒衣壳亚单位蛋白的多克隆抗体，我们利用这些抗体进行了CA6病毒的病毒学鉴定，并初步建立了CA6病毒的小鼠感染模型，为进一步的临床诊断研究及疫苗的开发奠定了基础。　　在第二部分工作中，利用昆虫杆状病毒表达系统将CA6/Gdula的P1和3CD进行共表达，检测显示P1蛋白可以被3CD正确切割获得衣壳蛋白VP0，VP1和VP3，这些蛋白能自发组装形成完整的病毒样颗粒(Virus-like Particle，VLP)，并且，经VLP疫苗免疫的小鼠可以产生很强的特异性血清抗体反应。由于缺乏适合的CA6病毒培养细胞系，阻碍了体外中和实验的实施，所以直接采用体内被动保护和主动保护实验进行疫苗效果的评估。一方面，我们用anti-CA6-VLP血清腹腔注射七日龄新生小鼠后，分别用原始株CA6/Gdula或临床分离株CA6/S0087b病毒进行攻击，结果显示，anti-CA6-VLP血清均能够完全地保护小鼠免受同源病毒和异源病毒的感染。另一方面，选取新生乳鼠在1日龄和7日龄进行CA6-VLP疫苗的腹腔注射免疫，14日龄时分别用原始株CA6/Gdula或临床分离株CA6/S0087b病毒进行攻击，结果显示，CA6-VLP疫苗可以有效地保护小鼠免受该两种病毒的感染。　　由以上研究结果可得出如下结论:　　1)本研究通过原核表达和纯化获得CA6-VP0，VP1和VP3衣壳亚单位蛋白，免疫动物收获anti-CA6-VP0，anti-CA6-VP1和anti-CA6-VP3特异性多克隆抗体，并且成功建立了CA6病毒的定性和定量分析方法。　　2)利用昆虫杆状病毒表达系统成功制备CA6的病毒样颗粒疫苗，腹腔免疫小鼠诱导产生高效价、特异性的中和抗体。该血清抗体能够在小鼠感染模型上有效地保护其免受本株CA6病毒(CA6/Gdula)以及异源临床分离株CA6病毒(CA6/S0087b)的感染;并且用该表达纯化的CA6-VLP主动免疫小鼠后亦可保护其免受以上两种病毒的攻击。以上结果明确了CA6病毒样颗粒作为CA6疫苗的有效性。