研究背景：肺癌是全世界最常见诊断的恶性肿瘤,也是死亡率最高肿瘤之一。临床上发现的肺癌病人大多数已经处于中晚期,以目前的治疗手段,病人的五年总生存率只有约15%左右。在肺癌病人中,80%的患者是非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)。改进和提高NSCLC病人的诊断和治疗是迫切需要解决的问题。自从第三代抗肿瘤药物和以表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)酪氨酸酶抑制剂(tyrosine kinases inhibitors, TKIs)为代表的靶分子治疗方法的应用,部分NSCLC患者的生存时间有了一定的提高。但TKIs如厄洛替尼(Erlotinib)和吉非替尼(Gefibinib)治疗的敏感性与EGFR基因突变相关。这种突变在NSCLC病人中实际发生的比例不高。先前的研究已经表明,上皮癌细胞发生上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)是影响EGFR-TKIs敏感性的因素之一。因此,进一步加深理解NSCLC发展过程中与EMT相关的分子表达的变异及功能,或许能为NSCLC提供新的治疗策略。EMT是多种动物胚胎发育过程中的基础事件,涉及组织器官的形成。在疾病方面的研究也发现与癌症的发展密切相关,涉及癌细胞生物学的多个方面。上皮状态癌细胞转化为间质状态后,获得侵袭和转移的能力,是癌症发生转移的重要原因。此外,研究表明间质样癌细胞常常对传统治疗较耐受,和癌症预后差有关。体外NSCLC细胞系的对比研究表明间质状态癌细胞对EGFR-TKIs更耐受。连续TKIs处理上皮状态癌细胞,药物的敏感性逐步下降并发生EMT。临床试验中也发现在获得药物抵抗的病人中有部分患者癌组织有EMT。最近的研究发现,上皮状态的NSCLC细胞经转染诱导EMT后,癌细胞对生长因子受体信号依赖发生改变。这可能是间质状态癌对EGFR-TKIs的药物抵抗的原因。尽管已有大量的研究在揭示EMT发生发展机制,但直至目前还没有较好的抑制其发展过程的手段应用于临床。细胞钙信号参与调控各种细胞生物学进程,如细胞增殖,周期,凋亡,基因转录表达,血管生成等,是细胞对外界刺激做出应答的快速反应信号。钙信号形成涉及受体,钙通道,传感器,效应器,钙敏感激酶,钙泵和钙交换器。在许多类型癌细胞,钙信号相关蛋白表达异常和激活,有助于癌细胞的恶性增殖。过去十年中,有研究表明在致癌金属镍诱导支气管上皮细胞EMT过程中,以及几种因子或缺氧环境诱导癌细胞发生EMT,需要钙离子信号的参与。细胞钙信号形成是膜上钙离子通道在各种刺激因素作用下打开,胞外的钙离子内流,激活钙的效应器和敏感激酶及下游信号分子,从而介导基因转录等细胞周期和增殖必要的分子事件。钙离子通道包括电压门控通道(voltage operated calcium channel, VOCC)、蓄积释放操控钙离子通道(storage operated calcium channel, SOCC)和受体操控钙离子通道(receptor operated calcium channel, ROCC)。在肿瘤细胞,钙通道蛋白异常表达有助于癌细胞的恶性生长。如T型VGCC发现在食管癌细胞增殖中发挥重要作用,L型VGCC在结肠癌表达水平升高。瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道蛋白家族中部分成员参与细胞膜SOCC和ROCC通道构成。近十多年研究发现其家族成员在人类肿瘤中表达异常,成为钙通道与肿瘤发展关系的研究热点。瞬时受体电位(transient receptor potential, TRP)通道广泛分布于多种哺乳动物系统组织,参与调节各种细胞功能。根据其序列的相似性,TRP超家族可分为7个亚家族：TRPC (canonical), TRPV(vanilloid), TRPM (melastatin), TRPN (Drosophila NOMPC), TRPA (ankyrin), TRPML (mucolipin)和TRPP (polycystin)。而每一个亚家族又含有7个成员。越来越多的证据表明TRP通道分子在癌组织异常表达,并通过调节钙离子内流及激活下游信号,参与癌症的发展,如增殖,转移,侵袭和药物抵抗等方面。TRPC3和TRPC6在分子序列上有75%同源性,而且已有报道在介导细胞外的钙内流功能方面有互补作用。TRPC6已被证明与人类神经细胞胶质瘤、肝癌、乳腺癌和前列腺癌细胞增殖相关,而TRPC3在卵巢癌组织表达增高,涉及癌细胞的生长。在肺癌,有调查表明TRPC3表达与腺癌患者的预后相关,但作者并未对相关的机制做进一步的研究。而另一个研究表明TRPC家族成员可能参与非小细胞肺癌细胞分化。最近在非小细胞肺癌细胞诱导EMT转化实验模型中发现间质状态癌细胞中TRPC3在转录水平表达增高。然而,关于这种间质状态表达增高在癌细胞生长中功能还未知晓。本研究中,我们拟先在细胞水平上检测TRPC3通道在上皮状态和间质状态细胞系之间的表达差异,进一步检测其在癌细胞生长方面发挥的作用以及对活体成瘤的影响,并分析在癌细胞生长中发挥重要作用的MAPK-ERK和PI3K-AKT信号通路是否参与TRPC3通道调节癌细胞的生长,以及抑制TRPC3通道是否会影响EMT标志分子表达。最后,我们用非小细胞肺癌患者组织芯片上验证是否TRPC3分子在间质状态癌组织上表达增高以及与患者临床信息有无关系。为鉴定TRPC3通道分子作为癌组织发生EMT的NSCLC患者的治疗靶分子提供实验依据。研究目的：(1)选用永生化的人类支气管上皮细胞16HBE和非小细胞肺癌细胞A549、H460、H1299和95D,用Western-blot检测上皮细胞标志蛋白E-钙粘连蛋白(E-Cadherin)和间质标志分子波纹蛋白(vimentin)的表达,鉴定这些细胞系的上皮和间质状态状态。(2)在5个细胞系,用real time RT-PCR检测TRP通道分子mRNA的表达变化,包括有TRPM1, TRPM7, TRPM8, TRPC1, TRPC3, TRPC4 和 TRPC6。在转录水平检测TRPC3在间质和上皮两种状态间存在表达差异,同时鉴定其他与癌症相关的TRP通道是否也有相似变化。在此基础上,用Western-blot检测在两种状态癌细胞间存在差异的TRPC3蛋白表达水平,并进行细胞内表达定位检测。(3)构建发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)质粒,稳定转染癌细胞,下调TRPC3通道分子表达,和用特异阻断剂抑制通道来检测该通道对癌细胞体外增殖,周期及相关周期蛋白表达,和癌细胞转移的影响,以及对用刺激物诱导细胞外的钙离子内流的影响。(4)抑制TRPC3通道,检测MAPK-ERK和PI3K-AKT通路中ERK和AKT蛋白磷酸化,鉴定TRPC3通道是否影响这两条信号通路。并进一步用抑制剂分别或联合阻断MAPK-ERK和PI3K-AKT通路,分析细胞周期。鉴定TRPC3通道影响癌细胞生长的作用中是否有这两条通路的参与。(5)用裸鼠成瘤实验进一步检测通道抑制后对癌细胞在皮下成瘤生长,及瘤体组织中相关信号通路分子磷酸化、周期蛋白、EMT标志分子E-Cadherin和vimentin表达的影响。(6)检测NSCLC病人组织E-Cadherin、vimentin、TRPC3通道分子的表达。根据上皮和间质标志分子表达水平将病人组织分为上皮状态癌和间质状态癌,分析通道分子表达水平在两类状态癌组织的差异。并与病人的临床资料做进一步统计分析,寻找与癌症恶性有关的信息。研究方法：(1)细胞系鉴定：实验中应用的非小细胞肺癌细胞系A549、H460和H1299在美国菌种保藏中心(ATCC)网站上有原始细胞系的短串联重复序列(short tandem repeat, STR)图谱,我们将这三株细胞送南方医科大学法医鉴定中心做STR测序,与原始图谱比对,鉴定细胞是否有错误识别和交叉污染。(2)化学合成shRNA序列,用pSilencerTM puro试剂盒中提供的载体构建干扰质粒,电穿孔转染H1299细胞,嘌呤霉素筛选建立稳定干扰癌细胞株(shNC, shC3i1和shC3i.2)。(3)用实时定量RT-PCR检测细胞TRP通道的mRNA相对表达量,以及鉴定稳定转染shRNA质粒的H1299细胞TRPC亚家族成员的mRNA表达状况。(4)用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测细胞系和裸鼠肿瘤组织的上皮和间质标志分子、各细胞系中TRPC3基础表达量和干扰后蛋白表达水平、周期蛋白的表达,以及磷酸化ERK和AKT蛋白。(5)用细胞免疫荧光法检测TRPC3通道分子在细胞中表达定位。(6)细胞增殖实验：用噻唑蓝比色法(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium Bromide, MTT)检测癌细胞增殖及在阻断或干扰目的TRPC3通道情况下对增殖的抑制作用。用软琼脂克隆形成实验检测通道抑制对癌细胞恶性增殖的影响。(7)细胞周期检测：用碘化丙啶(1propidium iodide, PI)染细胞核,流式细胞仪检测目的TRPC3通道抑制对细胞周期进程的影响。(8)细胞钙内流实验：用绿色荧光染料Fluo-4/AM染色细胞内外钙离子,钙内流影像图用FV10-ASW 1.7 viewer软件在激光共聚焦显微镜下记录。(9)裸鼠成瘤实验：5-7周龄裸鼠皮下注射1×107个细胞,检测成瘤的大小和重量来反映TRPC3通道抑制对癌细胞活体成瘤的能力和生长的影响。(10)癌细胞转移实验：用伤口划痕实验和Transwell小室转移实验来鉴定抑制TRPC3通道对癌细胞转移能力的影响。(11)人类NSCLC组织芯片检测：用免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)检测组织上E-cadherin, vimentin和目的TRPC3通道分子表达水平。根据染色深度和染色细胞比例判断染色等级。用E-cadherin 和 vimentin表达将癌组织分为上皮型和间质型两类,比较两类癌组织中TRPC3高表达的比率。(12)统计分析采用SPSS13.0统计分析软件进行数据资料的统计分析。对于计量数据资料用Shapiro-Wilk法进行数据的正态性检验,符合正态分布计量资料均用均数±标准差描述。两样本均数比较采用独立样本t检验,多个样本均数比较采用单因素方差分析,进一步两两比较采用q检验。计数资料率之间比较采用卡方检验,间质和上皮状态癌组织患者资料与TRPC3通道表达水平之间关系分析采用Fisher确切概率法。所有统计分析均为双侧检验,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：(1)细胞系EMT标志分子检测Western blot检测上皮和间质标志分子条带,16HBE和A549细胞表达上皮标志E-cadherin, H460、H1299和95D细胞未见显影；而H1299细胞和95D细胞表达间质标志vimentin,其他三个细胞未见显影。定量分析结果显示16HBE细胞的E-cadherin相对表达量高于其他四个细胞系,A549的表达量低于16HBE,而高于H460、H1299和95D细胞,差异有统计学意义(P<0.05)；16HBE、A549和H460细胞的vimentin蛋白相对表达量无差异(P>0.05),而显著低于H1299和95D细胞的表达水平(P<0.05)。(2)细胞系TRP通道的mRNA表达TRPC3通道在四个癌细胞的mRNA表达相对16HBE增高,在四个癌细胞间,其中H1299和95D细胞表达无差异,高于H460细胞,而H460细胞又高于A549,差异有统计学意义(P<0.05)。同时检测的其他TRP通道分子,发现在5个细胞系间的表达变化与EMT变化无相关性。(3)细胞系TRPC3通道蛋白表达考虑商业化抗体的特异性问题,先用HEK293细胞瞬时转染T3-IRES质粒(TRPC3野生型)来确定条带位置。然后对5个肺细胞系样本检测,结果显示,在16HBE、A549和H460细胞显影较弱,而H1299和95D细胞有较强显影。定量分析表明,H1299和95D细胞TRPC3蛋白表达高于另外三个细胞系(P<0.05)。用免疫荧光检测发现TRPC3表达主要定位在细胞膜。(4)稳定转染shRNA的H1299细胞干扰效率鉴定用shRNA稳定转染H1299细胞,shC3i.1和shC3i.2细胞TRPC3的mRNA表达相对shNC细胞分别下降了75%和80%,蛋白表达水平分别下降了63.%和65%(P<0.05)。(5)抑制TRPC3通道对H1299细胞在诱导钙内流的影响用TRPC3/C6通道的直接激活剂1-油酰基-2-乙酰基-sn-甘油(1-oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol, OAG),或胎牛血清刺激细胞,细胞内出现瞬时的钙升高,然后逐步下降,维持在一个比起始钙浓度较高水平。而阻断TRPC3通道或下调分子表达使瞬时峰值及平台水平值较对照组低(P<0.05)。(6)抑制TRPC3通道对癌细胞增殖的影响分别用不同浓度的TRPC3通道特异抑制剂Pyr3处理4个非NSCLC细胞,MTT检测结果显示在药物剂量1、3和5uM三个剂量处理下,H1299和95D细胞增殖显著低于A549和H460细胞(P<0.05)。用3uM浓度的Pyr3处理H1299细胞,在加药后第2-6天,增殖均显著低于对照组细胞(P<0.05)。MTT检测两个稳定干扰细胞株在铺板后从第2天至第7天增殖均低于shNC细胞。克隆形成实验结果显示干扰组的细胞克隆数少于对照组(P<0.05)。而在shC3i.1细胞瞬时转染T3-IRES质粒,TRPC3表达恢复,也使细胞增殖恢复到和shNC细胞的增殖相同水平。(7)抑制TRPC3通道对H1299细胞周期影响结果显示加阻断剂和稳定干扰组的S期细胞的比例均较shNC细胞降低,而G0-G1期细胞比例增高(P<0.01)。G1-S期转化过程中发挥重要作用的周期蛋白D1(cyclin D1)表达亦降低。而瞬时转染T3质粒的shC3i.1细胞周期进程和cyclin D1蛋白表达均得到恢复。(8)抑制TRPC3通道对ERK和AKT活力的影响 shC3i.1和shC3i.2细胞的p-AKT和p-ERK表达均下降,而3uM浓度Pyr3处理的H1299细胞在有血清培养条件下的两个分子磷酸化都被抑制,而在无血清培养条件下的p-AKT下降,p-ERK表达未见明显变化。用Pyr3处理的A549细胞,AKT和ERK磷酸化作用未见明显变化。(9)ERK和AKT通路与细胞周期的关系用两个信号通路的抑制剂(U0126和LY294002)单独或联合处理H1299细胞,EKT和AKT在各自抑制剂作用下,蛋白磷酸化下降,而G0-G1期细胞百分比在升高,S期百分比下降(P<0.01)。(10)抑制TRPC3通道对裸鼠成瘤及瘤体组织中相关蛋白表达影响 出生后6周左右裸鼠右侧皮下接种107个细胞,包括shNC, shNC+Pyr3, shC3i.1和shC3i.2四个组别。从21-35天,肿瘤体积在阻断通道或下调TRPC3表达的三个组都低于shNC组(P<0.05)。第36d处死小鼠,瘤体组织称重结果显示在shNC+Pyr3,shC3i.1和shC3i.2三个组间无差异,都比shNC组低(P<0.05)。进一步检查p-AKT, p-ERK, cyclin D1, E-cadherin 和 vimentin的表达,以p-actin为内参,结果显示磷酸化AKT及cyclin D1 和 vimentin的表达下调(P<0.05),ERK磷酸化虽然在shC3i.2组有一定程度下调,但差异无统计意义,而上皮标志E-cadhenin表达无变化。(11)抑制TRPC3通道对H1299和95D细胞转移的影响划痕实验结果显示,在划痕后48h,添加Pyr3的细胞划痕愈合较对照组细胞慢。向中心的移动距离小于对照组细胞(P<0.05)。Transwell转移实验结果同样显示干扰或添加Pyr3组的细胞数少于对照组细胞数(P<0.05)。(12)TRPC3通道分子在非小细胞肺癌病人组织中的表达及意义 根据E-cadherin 和 vimentin染色强度将患者组织分为上皮状态和间质状态两类,各有39例和36例。TRPC3染色强度在2-3级的组织样本在两种状态癌组织中分别为占33.3%和63.9%,差异有统计学意义(P<0.01)。TRPC3表达水平与总肺癌病例以及间质状态肺癌病例的病理分级相关(P<0.01,P<0.05),与上皮状态肺癌病例的临床分期无关(／>0.05)。在TRPC3表达水平与患者年龄、性别、组织学类型、肿瘤大小和T分期之间无统计学意义的关系(P>0.05)。研究结论：(1)检测上皮和间质细胞的标志分子来鉴定细胞系的状态。支气管上皮细胞16HBE为对照,4个癌细胞系中A549表达上皮标志分子,未见间质标志分子表达,为上皮状态癌细胞；H460、H1299和95D上皮标志分子表达缺失,为发生EMT的癌细胞,其中H1299和95D细胞间质标志分子表达阳性。(2)对细胞系TRP通道mR_NA表达量检测。结果显示TRPC3表达在癌细胞系相对16HBE细胞增高,其中以间质标志分子表达阳性的H1299和95D细胞表达水平最高。其他TRP通道分子未见与癌细胞EMT有相似变化。而TRPC3通道蛋白在上述两个间质状态癌细胞表达亦增高。(3)体内外实验结果表明阻断TRPC3通道对间质状态的H1299细胞增殖有抑制作用,可能是通过抑制胞外的钙离子内流,调节AKT和ERK生长信号通路,抑制cyclin D1表达,使癌细胞不能顺利通过G1期,从而影响细胞DNA复制和倍增。(4)瘤体组织细胞的上皮和间质标志分子检测结果表明抑制TRPC3通道并不能直接逆转癌细胞已经发生的EMT,但阻断通道能中等程度抑制间质标志分子vimer tin表达。另外,与EMT相关的癌细胞转移特性,我们发现阻断TRPC3通道后,癌细胞的转移都受到一定程度的抑制。(5)NSCLC患者组织检查结果表明TRPC3通道在间质状态癌组织相对上皮状态癌组织中表达增高,而且与该类型癌症患者的病理分级相关。(6)在细胞系和癌症组织,TRPC3通道分子都在间质状态癌的表达增高,抑制该通道使细胞阻滞在G0-G1期,细胞生长受抑制,而且能中度下调间质标志分子的表达,抑制癌细胞转移。这些结果都表明TRPC3通道是间质状态NSCLC癌细胞的生长相关分子,或许能作为此类型肺癌患者治疗的目的分子。