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目的 应用噬菌体展示技术构建抗重组人肿瘤坏死因子α（rhTNF-α）的单链抗体库。为研究人rTNF-α受体结合位点，了解结构与功能的关系奠定基础，同时也为临床免疫治疗提供一种经济有效的新型抗体打下基础。 方法 利用噬菌体表面展示技术，绕过杂交瘤技术，用rhTNF-α，同时加入福氏佐剂，免疫BALB/C小鼠，取其脾脏，分离淋巴细胞，提取细胞总RNA，逆转录成cDNA第一条链，以该链为模板，用相应引物扩增小鼠免疫球蛋白VH基因和VL基因，构建VH、VL抗体库。由Linker-primer mix经重叠延伸反应将重链可变区基因与轻链可变区基因拼接成单链抗体（ScFv）。再用RS primer mix以ScFv为模板进行第二次PCR，同时在5′端及3′端分别加上Sfi Ⅰ、Not Ⅰ酶切位点，从而获得全套抗rhTNF-α的ScFv基因。以SfiⅠ／NotⅠ位点定向插入pCANTAB-5E噬菌粒载体，用氯化钙法转化大肠杆菌TG1，然后经M13KO7辅助噬菌体拯救，构建成全套抗rhTNF-α ScFv表面展示文库。 结果 1．从北京海军总医院购买的rhTNF-α，经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，考马斯亮蓝染色仅见目的条带，已达到电泳纯。以该蛋白来免疫小鼠，并用间接ELISA法检测血清中抗体效价可达10-5-10-6之间。符合构建抗体库的要求。 2．经RT-PCR扩增出重链、轻链可变区基因片段，经1.5％琼脂糖凝胶电泳，可清楚地看到340bp左右和325bp左右处有DNA条带即为山西医科大学生物化学与分子生物学2003届硕士学位论文 扩增的VH与VL DNA片段，与预期的片段大小相符。3.将重链、轻链可变区基因通过Linker primer mix拼接后，用RS primer mix进行第二次PCR，经1 .5%琼脂糖凝胶电泳，可清楚地看到一片 段大小约750bp左右的DNA片段。此DNA片段以Sfil入otl位 点定向插入pcA五叮AB一SE噬菌粒载体的gPm基因前方。氯化钙法 转化大肠杆菌TGI，构建抗thTNT一a抗体可变区基因文库。4.成功构建了噬菌体抗体库，经计算库容量约为4.6 xl。“。经M13Ko7 超感染后，测噬菌斑滴度为2.1 X10“pfu.L一‘。结论 本课题从提取免疫小鼠脾脏淋巴细胞的总RNA出发，运用RT一PCR、重叠延伸反应以及DNA重组技术等，获得了抗thTN下一a抗体的可变区VH、VL基因，成功地构建了全套抗rhTN下一a ScFv噬菌体表面展示文库。该文库为利用亲和富集筛选技术，获得具有TNF一a结合活性的完整重组噬菌粒克隆奠定了基础。同时也为进一步的基因工程抗体研究及抗原一抗体相互作用机理的阐明打下基础。