生命之所以不同于非生命物质,其中一个重要特征就在于它具有包括遗传和变异在内的进化。而作为分子进化和宏观进化的一个重要组成部分——水平基因转移(Horizontal Gene Transfer, HGT)——是指在近缘的、远缘的、甚至无亲缘关系的生物个体之间、细胞之间、或细胞内部的各细胞器之间,以及基因组内部所进行的遗传物质转移现象。这种现象广泛存在于自然界中,对物种基因组及其进化都起着十分重要的作用。目前,水平基因转移的研究主要集中在原核生物,而在真核生物基因组中水平基因转移的鉴定和研究尚处于滞后状态,仅在少数一些单细胞真核生物中取得了进展,而且它们的鉴定结果也都十分保守。其实真核生物同原核生物一样,也存在着大规模的水平基因转移事件,只是由于缺乏真核生物全基因组的系统检索方法而影响了其研究。有报道认为真菌是研究真核生物基因组中水平基因转移的一个优良谱系。作为系统分类定位于真菌界的微孢子虫(Microsporidia),是一类专性寄生于细胞内的单细胞真核生物。它的宿主范围非常广,包括几乎所有的无脊椎动物和脊椎动物,甚至于人类自身,并能引发目前尚无药物根治的微孢子虫病,因此受到广泛关注。家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)是最先被报道的、研究较为深入的一个典型种。近年,本实验室启动了家蚕微孢子虫的基因组测序计划,目前已经得到基因组7.8倍覆盖度的全基因组鸟枪法测序序列(whole genome shotgun, WGS、25倍覆盖度的Solexa测序数据、0.3倍覆盖度的miniBAC文库和含11,155条表达序列标签(expressed sequence tags, EST)的cDNA文库。预测家蚕微孢子虫基因组大小为15.7 Mb,18条染色体,包含4,305个编码基因。基于上述数据,开展了家蚕微孢子虫基因组中水平基因转移的研究,以期为在真核生物基因组中行之有效地鉴定水平基因转移提供一定参考,并为深入理解微孢子虫的基因组特征及其遗传进化模式,进而为预防和治疗微孢子虫病打下一定科学基础。1.家蚕微孢子虫基因组中水平转移基因鉴定基于家蚕微孢子虫全基因组数据,利用系统进化分析法和基于基因同源性全基因组统计的Darkhorse法,一共鉴定到55个可能水平转移基因。其中的48个(87.27%)被两种方法所共同确定,支持了该结果的可靠性。从这55个基因中随机抽取4个进行Southern杂交实验,结果表明这些水平转移基因确实存在于家蚕微孢子虫的基因组上,而非外来污染序列。此外,Darkhorse法的结果还进一步证实了微孢子虫与真菌的亲缘关系。Southern杂交结果展现出预测拷贝数两倍的条带信号,推测可能是由于家蚕微孢子虫双核多态性原因造成的。2.家蚕微孢子虫水平转移基因的基因特征及共线性通过核苷酸组成、密码子偏好性、转录活性、选择压力等基因特征方面的分析,发现家蚕微孢子虫水平转移基因与其全基因组具有明显差异。例如,就全基因组的平均值而言,水平转移基因的GC含量更高、密码子偏好性更弱、最优密码子选择相悖且密码子GC含量也更高、转录水平偏低(大多没有EST支持,或支持条数少)、Ka／Ks值偏大(正选择和中性选择的情况偏多)等等。这些结果在一定程度上支持55个水平转移基因确实是外源的。基于其他微孢子虫中同源基因的有无,将55个水平转移基因分为微孢子虫门物种分化前(the HGT before the divergence of microsporidia phylum, bHGT)和分化后(the HGT after the divergence of microsporidia phylum, aHGT)两类。而这一分类得到了上述基因特征、共线性分布图以及SOC (Self-Organizing Clustering)自主分类的支持,表明bHGT和aHGT确实存在差异。而且,相对于aHGT基因而言,bHGT更趋近于家蚕微孢子虫基因组。推测这可能是由于bHGT是在微孢子虫门物种分化前就已经转移进入了微孢子虫共同祖先的基因组中,随着物种进化,其原供体的基因组特征被逐渐消减,并慢慢地与微孢子虫基因组发生协同进化,逐渐趋向于微孢子虫的基因组特征,这正是水平转移基因的“同质化”(amelioration)过程；相对而言,aHGT进入家蚕微孢子虫基因组的时间较短,“同质化”效果尚不明显。3.家蚕微孢子虫水平转移基因的来源物种及转移时间家蚕微孢子虫水平转移基因的来源谱系很广,基本上大多数物种门都有来源,认为家蚕微孢子虫水平基因转移的来源物种可能是无差别的。其中,占比例最大的是细菌域(83.64%),这与目前大多数真核生物基因组报道的水平基因转移情况一致,推测是由于细菌类群大、种类多、生活环境多种多样、数据库中序列信息较多等原因造成的。检测到的水平转移方向都是外源物种向微孢子虫或家蚕微孢子虫转移,却没发现反过来的情况。认为可能是由于真核生物转移机制少、基因组大、且基因比较复杂等原因造成的。定量分析表明,12个bHGT的转移时间范围位于357～760百万年间,而3个aHGT的在11～73百万年间。由于上述数据量少,进而根据核苷酸组成差异进行定性分析,得出bHGT的转移时间大约是aHGT基因的1.55倍。肯定了bHGT的进化时间确实比aHGT的久远,再次支持了它们的分类。4.家蚕微孢子虫水平转移基因的功能作用大多数家蚕微孢子虫水平转移基因的功能未知,但在己知部分,代谢功能相关基因所占比例最大。这种情况同于己报道的溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)和阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis).认为这是由于水平基因转移具有简单性造成的,即相对于信息基因而言,操纵基因(如代谢功能基因)更为简单,更利于水平转移基因的获得。aHGT在基因组中主要扮演功能新增角色,而bHGT起功能补充作用。推测水平转移基因进入基因组,为该物种提供新基因新功能做出了巨大贡献,随着物种进化,外源基因需要适应基因组或在正选择压力下才能保留下来。因此,提供新功能的水平转移基因比扮演补充角色的更有被选择筛除掉的危险。故而,在物种分化之前就进入基因组的bHGT,在长期的选择作用下,保留下来更多的是只起到补充功能作用的基因。水平转移基因进入基因组事件与不适应基因组的基因被选择事件是同时发生着的,现今基因组中的水平基因转移是两事件动态平衡后的结果。此外,在甲羟戊酸途径中,发现一个水平转移基因起到了联通整条通路的作用。表明水平转移基因对物种的生命活动,尤其是代谢功能方面,发挥着重要作用。5.家蚕微孢子虫单个水平转移基因的具体分析通过对家蚕微孢子虫锰超氧化物歧化酶基因(NbMnSOD)进行分析,发现SOD基因的系统进化树、蛋白质结构和亚细胞定位之间存在着一定联系,且三者的结果都表明NbMnSoD来源于某一变形菌门(proteobacteria)物种的水平基因转移。NbMnSOD发生了串联重复事件,且重复基因比原基因序列变异更大、更不保守、进化更快,结构特征也有很大变化。意味着该基因可能已经进化出新功能,而且选择压力结果推测该进化是由自然选择所控制的。虽然丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(serpin)分布广泛,但都只是在少数一些物种中零星存在,认为这种不连续分布也只有通过水平基因转移现象才能得以解释。结合系统进化分析,推测家蚕微孢子虫serpin可能来源于一种痘病毒(poxViridae)物种。6.家蚕微孢子虫基因组中转座元件分析利用多种软件和数据库,鉴定了基因组内的水平基因转移——转座元件。家蚕微孢子虫基因组中的转座元件占据了相当大的比例(36.12%),认为是导致其基因组偏大的原因之一大部分转座元件均属于未报道的新类型,而已知中的最大一类是Ty3／Gypsy型LTR反转座元件。基于以前研究,新的6个具转录活性的家蚕微孢子虫LTR反转座元件(Nbr)被鉴定,表明它们仍然发生着转座并起着改造基因组的作用。另外,转座元件的拷贝数少、多态性高、结构域不完整等特点,又说明缺失和丢失事件也发生在这些转座元件中。这种矛盾现象己被报道,认为是基因组中转座元件进行转座和发生消失两种事件的动态平衡结果,并且这一平衡受到自然选择的调控。通常,为了最大程度降低转座事件对基因组造成的破坏,转座元件受到的多是强烈负选择压力,而且它们的转座位点多位于两不相关的共线性区域之间,对基因组确实影响不大。然而,Nbrll却不同于常规转座元件,它整合进了一个保守共线性区域内部,且可能导致了基因组重排。进一步分析认为该变异可能适应了基因组,并对物种有利,因此Nbrll在正选择压力下保留了下来。相对其他微孢子虫而言,家蚕微孢子虫可能由于寄生宿主不同等原因,基因组中可以存在着大量转座元件,且它们有活性有作用。甚至,具有一些来自于其宿主家蚕的转座元件,就更加说明转座元件在基因组及其进化上起着重要作用。相对于其他己报道水平基因转移的物种,家蚕微孢子虫中鉴定到的水平转移基因所占基因组比例更大,其中一个重要原因可能就在于转座元件使得水平转移基因能更容易的插入并整合到基因组中、以及促进了水平转移基因在基因组中的传播。而这一推测也得到了利用二者距离和多基因组统计所得出的基因组中水平基因转移与转座元件具有正相关性结论的支持。