在植物基因工程的发展过程中,根癌农杆菌介导的遗传转化是研究最清楚和应用最广泛的一种方法,因其费用低、拷贝数低、重复性好、基因沉默现象少、转育周期短及能转化较大片段等独特优点而备受科学工作者的青睐,因此,我们用这种技术研究了WRKY基因家族。目前有许多研究表明,WRKY转录因子家族参与了植物防御反应,然而,有关特定WRKY蛋白在植物防御系统中作用的研究报道仍然是很少的。本文从烟草中克隆了一个对烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)具有应答的WRKY基因,它与其他植物中的WRKY40同源性较高,因此命名为NtWRKY40。为了解Nt WRKY40基因的功能,本研究通过构建35S:NtWRKY40过表达载体和RNAi-Nt WRKY40抑制表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法获得转基因植株。分别在病毒侵染后的三个阶段(6h、3d、9d)取非侵染叶,利用实时荧光定量PCR技术,检测Nt WRKY40基因以及病毒外壳蛋白基因(Coat Protein,CP)和移动蛋白基因(Move Protein,MP)的表达水平,结果表明:野生植株在侵染后6h和3d这两个阶段,NtWRKY40的表达仅升高了一两倍,但侵染后9d,NtWRKY40的表达量显著升高,达到一百五十多倍;而35S:NtWRKY40过表达转基因植株在病毒侵染后的三个时间段中,NtWRKY40的表达均没有显著变化。为了研究病毒侵染后35S:NtWRKY40过表达转基因植株和野生植株中病毒的表达特点,分析NtWRKY40基因与感病程度的关系,我们分别以转基因植株和野生植株病毒侵染后6h的病毒表达量为参照,分析侵染后3d和9d野生植株和转基因植株中病毒基因CP和MP的表达变化,从我们的数据以及植物的感病情况可以得出,35S:NtWRKY40过表达植株对TMV的敏感性较野生型植株更强。由于目前所获得的RNAi-Nt WRKY40转基因植株较少,还未进行病毒侵染实验。通过上述结果可以推测NtWRKY40在烟草逆境应答响应中具有重要的作用,为进一步研究该基因的功能提供基础。在农杆菌的转化过程中经常出现多个T-DNA插入同一个位点和多插入位点的频繁出现,这些T-DNA串联重复结构经常会导致目标基因的共抑制,甚至是基因沉默,从而影响后续的实验,因此我们使用了一种高效准确的实时荧光定量PCR方法,筛选和定量大量的转基因植物株系中T-DNA的拷贝数和分析T-DNA串联结构。此外,我们还结合了多倍仪PCR方法,快速的克隆和分析串联结构间的填充DNA序列,序列分析表明,在直接串联的T-DNA结构中填料DNA和左右边境残余的序列是多变的。