猪丁型冠状病毒(PDCoV)是2014年第一次在美国检测出的一种猪源冠状病毒,属于冠状病毒科,δ冠状病毒亚群,为单股正链有囊膜的RNA病毒。PDCoV属于肠道疾病病原之一,能够引起感染猪出现水样腹泻、呕吐和脱水等症状,仔猪最易感,新生仔猪死亡率为30%～40%。另外,PDCoV常与PEDV、TGEV等病原混合感染,使检测、防控的难度加大。自2014年2月首次检出以来,目前,已有至少包括中国、美国、韩国等在内的7个国家报道指出猪群中存在PDCoV的感染,威胁着全球生猪的安全,对养猪行业产生不同程度的损失。本实验室针对PDCoV M基因和N基因分别建立了特异性的RT-PCR检测方法,能对临床样品进行快速有效的检测;原核表达PDCoV N蛋白并以其为包被抗原,建立了一种PDCoV间接ELISA抗体检测方法;运用ST细胞对PDCoV阳性病料进行细胞分离,将分离株命名为JS-LYG-2014,采用分段扩增的方式得到其全基因组序列并分析,对0日龄仔猪进行攻毒,探究其致病性;本次实验为临床样品中抗原及抗体的检测提供了有效的工具,为PDCoVs分子流行病学调查、致病性及致病机理的研究奠定了基础。具体实验内容如下:1依据GenBank中登录的PDCoV核苷酸序列,分别针对M基因和N基因设计、合成一对特异性引物,在我国首次报道了 PDCoV的RT-PCR检测方法。研究结果表明,所建立的两种RT-PCR检测方法仅对PDCoV核酸具有特异性扩增,对其它猪主要病毒核酸的扩增均呈阴性,特异性较好;M基因RT-PCR方法对PDCoV最低检测限为104拷贝/μL,N基因RT-PCR方法可达103拷贝/μL,敏感性均较高;分别采用M基因和N基因的RT-PCR方法对2014年～2015年我国华东地区猪场的临床样品进行检测,结果显示PDCoV总阳性率分别为2.85%(14/492),4.75%(25/526),其中腹泻样品中阳性率分别为18.60%(8/43),25.76%(17/66),表明我国猪群中存在PDCoV感染。本研究建立的RT-PCR方法可以作为临床检测PDCoV的一种有效手段。2本次研究根据GenBank中登录的PDCoV N基因序列,设计合成一对原核表达引物,对其N基因进行RT-PCR扩增,连接pCold1载体诱导表达,并对表达的蛋白做western blot验证。以纯化的N蛋白为包被抗原,经过系列条件优化,建立了一种PDCoV重组N蛋白的间接ELISA抗体检测方法。该ELISA方法特异性较好,与常见的七种主要猪源病毒阳性血清均无特异性反应。采用该ELISA方法对我国2012年～2016年间收集的不同地区猪场的351份临床血清样品进行了检测,表明本实验建立的ELISA方法可以作为检测PDCoV抗体的一种有效手段。3本实验室从江苏省某猪场发病仔猪的肠道中分离到一株PDCoV,设计16对引物对病毒进行扩增,拼接后的全基因组序列与NCBI中已有的其它19株PDCoV参考株进行序列比对,并进行同源性和进化树分析,将第10代PDCoV细胞毒对0日龄仔猪进行攻毒试验探究其致病性。结果发现,本实验室分离到的PDCoV(JS-LYG-2014)全长共25370个核苷酸,全基因组结构为5’UTR-ORF1a-ORF1b-S-E-M-NS6-N-NS7-3’UTR。在主要结构蛋白中,S基因变异程度最大,氨基酸同源性在97.4%～99.6%之间,不同毒株之间E、M、N基因同源性较高。全基因组进化树分析表明,JS-LYG-2014与大部分中国毒株处于同一分支,其中与PDCoV-CHJXNI2-2015同源性最高。感染仔猪表现出严重腹泻,伴有肠壁变薄透明,肠绒毛萎缩等典型病理变化。本次实验提醒我们要加强对PDCoV的监测,为后期PDCoV进一步的致病性研究提供了依据。