【摘 要】
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目的:血栓形成（Thrombosis）是造成全球疾病负担的主要因素,也是导致死亡的主要原因。据统计,全世界约有四分之一的人死于血栓。除此之外,血栓形成也是缺血性心脏病、缺血性中风和静脉血栓栓塞症（Venous thrombosis embolism,VTE）的常见病理。VTE包括深静脉血栓（Deep venous thrombosis,DVT）形成和肺血栓栓塞症（Pulmonary embolis
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81830099,82003500）；
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目的:血栓形成（Thrombosis）是造成全球疾病负担的主要因素,也是导致死亡的主要原因。据统计,全世界约有四分之一的人死于血栓。除此之外,血栓形成也是缺血性心脏病、缺血性中风和静脉血栓栓塞症（Venous thrombosis embolism,VTE）的常见病理。VTE包括深静脉血栓（Deep venous thrombosis,DVT）形成和肺血栓栓塞症（Pulmonary embolism,PE）。在全球范围内,公众对血栓形成,尤其是VTE的认知度较低。近年来,纳米二氧化钛（Titanium dioxide nanoparticles,TiO2NPs）由于具有强催化活性、表面吸附、光催化活性和紫外线吸收等被广泛应用于生产生活领域。随着TiO2NPs的广泛应用,人们越来越关注其对人体健康的影响。相关研究发现,TiO2NPs可引起细胞内活性氧自由基（Reactive oxidation stress,ROS）的升高,进而导致细胞DNA损伤甚至死亡。ROS的升高也是静脉血栓形成机制之一。核转录因子NF-E2相关因子2（Nuclear factor erythroid-derived 2-like 2,NFE2L2,又称Nrf2）介导的适应性抗氧化反应体系是对抗氧化应激的多种细胞防御机制中,最重要且研究最多的调控机制。本研究旨在系统阐明转录因子Nrf2在TiO2NPs暴露所致小鼠静脉血栓形成中的作用及相关机制、理清TiO2NPs致红细胞毒性及其在静脉血栓形成危害发展中的作用,以期利用调控NRF2活性等途径为静脉血栓防治提供新的思路。研究方法:1.将不同基因型的小鼠随机分为四组:Nrf2-WT溶剂对照组（Nrf2-WT,Veh）、Nrf2-KO溶剂对照组（Nrf2-KO,Veh）,Nrf2-WT造模组（Nrf2-WT,TiO2NPs）和Nrf2-KO造模组（Nrf2-KO,TiO2NPs）。用1%的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠,给予Veh组股静脉注射体重（g）×10/μL生理盐水作为溶剂对照,造模组股静脉注射体重（g）×10/μL TiO2NPs（25 mg/kg）注射剂作为造模组。注射1h后,摘单侧眼球取新鲜小鼠血液于商品化1.5 m L EDTA抗凝离心管和3%的肝素抗凝管中,4℃保存,不超过24 h,进行相关生化指标检测。2.体外血液样品的检测:使用对应试剂盒检测红细胞丙二醛（Malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（Glutathione,GSH）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物（Glutathione Peroxidase,GPx）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）水平;通过流式细胞仪、血细胞分析仪检测红细ROS、磷脂酰丝氨酸（Phosphatidylserine,PS）、微泡（Microvesicles,MV）及红细胞数量指标;通过光学显微镜、共聚焦显微镜观察小鼠红细胞形态学、红细胞聚集及红细胞PS的产生情况。结果:1.TiO2NPs能够诱导小鼠静脉血栓的形成,与Nrf2-WT组相比,Nrf2-KO组小鼠形成的静脉血栓重量更重,差异具有统计学意义（P＜0.05）。2.TiO2NPs并未诱导小鼠红细胞溶血的发生,但当给予TiO2NPs处理之后,Nrf2-KO组小鼠红细胞数量及红细胞压积与Nrf2-WT组相比有明显的降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）。光学显微镜观察显示,小鼠红细胞形态发生了明显的改变,有较多棘突状红细胞生成。3.当给予TiO2NPs处理之后,Nrf2-KO组小鼠红细胞内ROS的生成与Nrf2-WT组相比,有明显升高,差异具有统计学意义（P＜0.05）,但我们并没有发现小鼠红细胞膜MDA水平及红细胞内总GSH含量的变化。但是,我们发现,当给予TiO2NPs处理之后,与对照组相比,Nrf2-KO组小鼠红细胞内谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶的含量均有所降低,差异具有统计学意义（P＜0.05）,说明红细胞内抗氧化水平有所下降。4.当给予TiO2NPs处理之后,与对照组相比,Nrf2-KO组小鼠红细胞PS、MV的产生明显增加,小鼠红细胞MV中产生的PS也明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）。同时我们发现,与对照组相比,Nrf2-KO组小鼠红细胞凝血酶的产生明显增加,差异具有统计学意义（P＜0.05）,且通过共聚焦显微镜观察,进一步证实了这一点。于此同时,通过光学显微镜观察,我们还发现Nrf2-KO组小鼠红细胞聚集情况更加明显。结论:1、Nrf2的缺失能够加重TiO2NPs诱导的小鼠静脉血栓的形成;2、Nrf2的缺失促进TiO2NPs的暴露所导致的小鼠红细胞内活性氧的生成增加及抗氧化酶活性的下降,使红细胞形态学产生改变,并加重了红细胞膜PS的暴露,进而导致红细胞凝血酶的生成增多,以及加重红细胞聚集,最终导致静脉血栓形成增多。
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