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目的:1.通过观察清血毒胶囊(Qing Xue Du Capsule)对银屑病小鼠症状、皮损病理变化、角质形成细胞增殖、凋亡及相关炎症因子的影响,初步探究清血毒胶囊干预寻常型银屑病的作用机制。2.通过观察清血毒胶囊对HaCaT细胞增殖、凋亡及sonic hedgehog(SHH)信号通路的影响,进一步探究清血毒胶囊干预寻常型银屑病的作用机制。3.通过观察清血毒胶囊对rh SHH诱导的HaCaT细胞增殖、凋亡及抗凋亡蛋白Bcl-2表达的影响;验证清血毒胶囊通过抑制SHH信号通路及下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表达,促进HaCaT细胞凋亡,抑制HaCaT细胞增殖,达到干预寻常型银屑病的作用。方法:1.48只BALB/c小鼠随机分为空白组、清血毒胶囊低剂量组、清血毒胶囊中剂量组、清血毒胶囊高剂量组、模型组、甲氨蝶呤组,每组各8只。予咪喹莫特软膏(5%)外涂小鼠背部皮肤制备寻常型银屑病模型,同时予治疗药物干预,连续干预7d。记录小鼠症状并予PASI评分;干预结束后,取小鼠皮损组织,采用HE染色检测小鼠皮损部病理变化并予Baker法评分;采用IHC检测小鼠皮损部Ki-67表达情况,采用TUNEL检测小鼠皮损部角质形成细胞凋亡情况;分别采用WB和RT-PCR技术检测小鼠皮损部Bcl-2蛋白表达和m RNA相对表达量,采用ELISA检测皮损部位IL-1β和IL-6蛋白含量。2.体外培养HaCaT细胞,设置7组,分别为空白组、对照组、清血毒胶囊0.125、0.25、0.5、1、2mg/m L剂量组,除空白组外,其余各组接种生长状态良好的HaCaT细胞悬液,培养24h后,予相应浓度的清血毒胶囊干预;干预结束后,采用CCK8法检测清血毒胶囊对HaCaT细胞存活率的影响。筛选出正式实验清血毒胶囊的浓度及干预时间;正式实验分4组,分别为对照组、清血毒胶囊低、中、高剂量组,接种适量HaCaT细胞悬液于六孔板;干预结束后,采用流式细胞术检测清血毒胶囊对HaCaT细胞凋亡情况的影响;采用WB检测清血毒胶囊对HaCaT细胞SHH、SMO、Gli1、Bcl-2蛋白表达的影响;采用RT-PCR技术检测清血毒胶囊对HaCaT细胞SHH、SMO、Gli1、Bcl-2 m RNA表达水平的影响。3.常规培养HaCaT细胞,分别设置对照组、rh SHH诱导组(0.5μg/ml)、rh SHH诱导(0.5μg/ml)+清血毒胶囊组、rh SHH诱导(0.25μg/ml)+清血毒胶囊组,各组5个复孔,接种适量HaCaT细胞悬液于六孔板;干预结束后,采用CCK8法检测清血毒胶囊对人重组SHH诱导的HaCaT细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测清血毒胶囊对人重组SHH诱导的HaCaT细胞凋亡的影响;分别采用WB及RT-PCR技术检测清血毒胶囊对人重组SHH诱导的HaCaT细胞Bcl-2蛋白表达量及m RNA表达水平的影响。结果:1.与空白组比较,模型组PASI分值显著升高(P<0.0001),小鼠症状Baker法评分分值显著升高(P<0.0001),表皮Ki-67和TUNEL阳性细胞率显著升高(P<0.0001,P<0.05),Bcl-2蛋白和m RNA表达量显著升高(P<0.05,P<0.001),IL-1β和IL-6的表达显著增加(P<0.01);与模型组比较,甲氨蝶呤组、清血毒胶囊中、高剂量组PASI分值显著降低(P<0.0001),甲氨蝶呤组、清血毒胶囊中、高剂量组Baker法评分分值显著降低(P<0.01,P<0.0001),甲氨蝶呤组、清血毒胶囊中、高剂量组Ki-67表达显著降低(P<0.01,P<0.0001),甲氨蝶呤组、清血毒胶囊中、高剂量组TUNEL阳性细胞率显著下降(P<0.05),甲氨蝶呤组、清血毒胶囊中、高剂量组Bcl-2蛋白表达均显著下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),甲氨蝶呤组、清血毒胶囊低、中、高剂量组Bcl-2m RNA表达量显著下调(P<0.01,P<0.001,P<0.0001),甲氨蝶呤组、清血毒胶囊中、高剂量组IL-6和IL-1β蛋白含量显著降低(P<0.05,P<0.01)。2.清血毒胶囊对HaCaT细胞的抑制作用随药物浓度和时间的增加逐渐增强;清血毒胶囊处理24小时后低于0.25mg/ml的浓度无明显细胞抑制作用,处理48小时后低于0.125mg/ml的浓度无明显细胞抑制作用;清血毒胶囊干预24小时的细胞半数抑制浓度(half maximal inhibitory concentration,IC50)为1.859mg/ml;干预48小时IC50为0.66mg/ml;本研究选择小于半数抑制浓度用于正式实验,正式实验,清血毒胶囊的浓度选择低、中、高(0.125、0.25、0.5mg/ml)三个剂量组,干预24小时。与对照组比较,清血毒胶囊中、高剂量组HaCaT细胞凋亡率显著升高(P<0.05,P<0.001),清血毒胶囊高剂量组SHH、SMO、Gli1的蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01),清血毒胶囊低、中、高剂量组Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05,P<0.01,P<0.001),清血毒胶囊高剂量组Bcl-2、SHH、Gli1 m RNA相对表达量显著下降(P<0.05,P<0.01),清血毒胶囊低、中、高剂量组SMO m RNA表达量显著下降(P<0.01,P<0.001,P<0.0001)。3.与对照组比较,rh SHH诱导组(0.5μg/ml)细胞存活率显著上调(P<0.05),细胞凋亡率显著降低(P<0.01),Bcl-2蛋白和m RNA表达量显著上升(P<0.05,P<0.01);与rh SHH诱导组(0.5μg/ml)比较,rh SHH诱导(0.5μg/ml)+清血毒胶囊组和rh SHH诱导(0.25μg/ml)+清血毒胶囊组细胞存活率均显著下降(P<0.01,P<0.05)且rh SHH诱导(0.5μg/ml)+清血毒胶囊组和rh SHH诱导(0.25μg/ml)+清血毒胶囊组之间细胞存活率具有显著性差异(P<0.01),rh SHH诱导(0.25μg/ml)+清血毒胶囊组细胞凋亡率显著上升(P<0.05),rh SHH诱导(0.25μg/ml)+清血毒胶囊组Bcl-2蛋白表达显著下降(P<0.05),rh SHH诱导(0.25μg/ml)+清血毒胶囊组Bcl-2的m RNA相对表达量显著下降(P<0.01)。结论:1.清血毒胶囊具有改善银屑病小鼠皮损症状和病理损伤的作用;清血毒胶囊干预银屑病效果显著,值得推广应用。2.清血毒胶囊体外具有抑制HaCaT细胞增殖,促进HaCaT细胞凋亡、降低SHH信号通路相关蛋白SHH、SMO、Gli1及Bcl-2表达的作用;3.rh SHH具有负向调控清血毒胶囊抑制HaCaT细胞增殖,促进HaCaT细胞凋亡的作用;由此推断,清血毒胶囊通过抑制SHH信号通路活性及Bcl-2表达,促进HaCaT细胞凋亡,抑制HaCaT细胞增殖,发挥干预银屑病的作用。