黄芩为唇形科植物黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根,归肺、胆、胃、大肠经,具有清热燥湿、泻火解毒等功效。黄芩的主要活性组分有黄酮和多糖。植物多糖已报道的药理活性有免疫调节、抗炎、调节肠道菌群、降血糖、降血脂、抗肿瘤等,且黄岑治疗慢性炎症和溃疡性疾病与多糖多种活性相关。因此,开展对黄芩中多糖组分的研究,对解释黄芩的活性功能具有重要意义。综合国内外文献来看,对黄芩多糖各方面的探索远远落后于黄芩黄酮。对于黄芩多糖的相关报道,仅限于对黄芩粗多糖展开提取工艺、体内外抗氧化方面的研究,并未见关于黄芩多糖的分离纯化、结构解析、抗炎和调节肠道菌群多样性与功能等方面的研究。因此,本课题以黄芩为原料,优化黄芩多糖的提取工艺,分离纯化得到纯化多糖,初步表征其结构,探索其抗溃疡性结肠炎可能的机制,为深入开展黄岑多糖的研究奠定基础。本论文共分五章节内容。一、绪论本部分查询、总结、归纳多糖相关文献,系统总结了多糖分离纯化、结构解析的方法与技术及多糖药理活性功能研究的现状,以期为黄芩多糖的结构与活性研究提供参考和借鉴。同时,对肠道菌群与药物吸收代谢的关系研究进行梳理和归纳,指导本课题以后的研究方向。二、黄芩多糖的提取分离纯化及结构初步表征1黄芩多糖提取分离纯化1.1响应面法优化黄芩多糖提取最优工艺为提取时间4.3 h、提取温度93℃、液料比24:1。1.2提取后的粗多糖经Sevag法除蛋白、3%H202溶液脱色、透析、醇沉、冷冻干燥后进行DEAE-52纤维素离子交换柱层析、Sephadex G-100凝胶柱层析后得到5个黄芩多糖:SP1-1、SP2-1、SP2-2、SP3-1、SP3-2。2黄芩多糖结构初步表征2.1高效凝胶渗透色谱法显示得到的5个黄芩多糖均为单峰,GPC软件计算得其重均分子量分别为 455980 g/mol、3717767 g/mol、1641491 g/mol、4464034 g/mol、2181324 g/mol。2.2 PMP柱前衍生化HPLC法测定黄芩多糖的单糖组成,分析结果显示,SP1-1主要由甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖和阿拉伯糖组成,摩尔比为2.14:3.61:1.00:2.86:5.98:36.39;SP1-1主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成,摩尔比为:5.06:21.24:1.00:20.25:3.49:50.90:228.77:2.40;SP2-2主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成,摩尔比为:6.83:7.73:1.00:77.61:2.49:2.20:3.56:19.10:4.79;SP3-1 主要由甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成,摩尔比为:4.57:26.90:1.00:30.27:1.42:24.29:197.16:1.56;SP3-2 主要由甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖组成,摩尔比为:6.58:9.02:1.00:78.72:1.51:2.40:5.14:4.23。2.3扫描电镜观察多糖形态:SP1-1呈蜂窝状结构,SP2-1和SP3-1呈不规则形状,SP2-2和SP3-2呈片状结构。2.4红外光谱解析发现,5个黄芩纯化多糖有多糖特征吸收峰,其中SP1-1、SP2-2、SP3-1、SP3-2是乙酰化多糖,且SP2-2主链以β糖苷键连接。紫外光谱解析发现,5个黄芩纯化多糖在260nm和280nm左右均无吸收峰,说明均不含有核酸和蛋白质。三、黄芩多糖SP1-1通过抑制NF-κ B通路和NLRP3炎症小体活性改善小鼠溃疡性结肠炎1小鼠饮用3%DSS水溶液连续一周成功建立C57BL/6小鼠急性溃疡性结肠炎模型,研究黄芩多糖SP1-1对模型小鼠溃疡性结肠炎的作用及其机制。结果显示,黄芩多糖SP1-1可以降低UC小鼠的DAI、组织学评分和MPO活性,降低血清和结肠组织中炎症因子的表达水平,如IL-1β、IL-18和TNF-α。SP1-1缓解巨噬细胞浸润,降低DSS诱导UC小鼠腹腔巨噬细胞中cleaved caspase-1表达。2 SP1-1抑制NF-κ1B信号激活:SP1-1剂量依赖性地降低细胞核中NF-κB p65数量。在THP-1源性巨噬细胞,LPS提高p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表达水平,降低IκBα、IKKα和IKKβ表达水平。但是,SP1-1可以显著反转LPS的作用。LPS刺激后,细胞核中p-NF-kB p65表达水平升高,细胞质中降低。但是,SP1-1可以抑制p-NF-kB p65细胞核定位。3 SP1-1抑制NLRP3炎症小体活化:与空白组相比,DSS模型组中NLRP3和ASC蛋白的表达水平明显升高。然而,SP1-1可降低NLRP3和ASC蛋白的表达水平。此外,SP1-1显著降低 cleaved caspase-1、cleaved IL-1β 和 cleaved IL-18 表达。免疫沉淀分析显示,SP1-1阻断了 ASC 与 NLRP3 或 pro-caspase-1 的结合。四、黄芩多糖SP1-1对UC小鼠肠道菌群多样性和SCFAs的调节作用1黄芩多糖SP1-1调节UC小鼠肠道菌群多样性基于细菌16S rDNA序列,利用利用Illumina公司的Miseq PE300平台进行测序,研究黄芩多糖SP1-1对UC小鼠肠道菌群多样性的影响。黄芩多糖SP1-1增加溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群多样性和丰富度。物种venn图分析发现,与模型组相比,SP1-1高剂量组、SP1-1低剂量组的肠道菌群结构更接近空白组。黄芩多糖SP1-1回调F/B值使其更接近空白组值,表明SP1-1具有调整肠道群落结构的功能。β多样性分析发现,模型组与空白组的肠道菌群组成差异较大,黄芩多糖SP1-1高剂量组与低剂量组的肠道菌群分离不明显,两组均偏离模型组,更偏向空白组。黄芩多糖SP1-1可以提高有益菌丰度(Lactobacillus、Ruminococcaceae、Lachnospiraceae、Bjfidobacterium、Ro.seburia、Rikenellaceae),降低有害菌丰度(Enterococcus、Streptococcus、Turicibacter、Parasutterella),有利于缓解 DSS 诱导的UC小鼠症状,恢复肠道健康。2黄芩多糖SP1-1调节UC小鼠肠道SCFAs含量GC-MS法测定小鼠肠道中SCFAs含量。黄芩SP1-1高剂量、低剂量均可在一定程度上增加SCFAs的含量,高剂量效果更好。含量变化比较明显的SCFAs是乙酸、丙酸和丁酸。五、黄芩多糖SP1-1对UC小鼠肠道菌群功能的影响基于宏基因组技术探索黄芩多糖SP1-1对UC小鼠肠道菌群功能的影响。空白组、模型组、SP1-1低剂量组、SP1-1高剂量组四组样本在EggNOG、KEGG、CAZy数据库中的PCA分析和NMDS分析均发现,模型组与空白组功能基因相距较远,黄芩多糖SP1-1低剂量组与黄芩多糖SP1-1高剂量组界限不明显,但是与模型组相比,都更偏向空白组。模型组富集的主要区别与其它组的基因类型是细胞加工和信号传递类,黄芩多糖SP1-1干预组富集的主要区别与其它组的基因类型新陈代谢类、信息储存与加工类和细胞加工和信号传递类。与KEGG数据库比对,模型组主要富集的基因类型是新陈代谢、遗传信息处理、细胞过程和有机体系统相关的基因,黄芩多糖SP1-1干预组主要富集的基因类型是新陈代谢、环境信息处理、细胞过程和人类疾病相关的基因。与CAZy数据库比对,模型组的核心酶系有糖苷水解酶和糖基转移酶,黄芩多糖SP1-1干预组的核心酶系有糖苷水解酶、糖基转移酶和碳水化合物结合模块。DSS刺激扰乱了肠道菌群的功能,黄芩多糖SP1-1干预后,可缓解肠道菌群功能的紊乱,使其趋向于正常。