论文部分内容阅读
本研究是从新疆的一种经济作物鹰嘴豆中克隆生物节律钟LATE ELONGATED HYPOCOTYL(LHY)的cDNA全长序列,进行序列信息学分析,研究其RNA的相对表达量以及原核表达载体构建。对该基因的研究有助于探索光周期途径鹰嘴豆成花的分子调控机制。可作为鹰嘴豆花期调控分子育种的目标基因。 (1)通过同源克隆策略,利用多聚酶链式反应(PCR)结合3-RACE和5-RACE技术,克隆鹰嘴豆生物节律钟基因LHY的cDNA全长序列,其核苷酸序列长度为3061 bp,包括2220 bp的完整开放阅读框(ORF),编码739个氨基酸。设计全长引物对其进行验证,通过对拼接结果得到的cDNA序列和验证所得的序列,二者一致,说明得到鹰嘴豆LHY基因,命名为Cicer arietinum Linn.LHY基因,将该基因序列提交到GenBank数据库中,获得基因登录号为KJ558378。 (2)应用生物信息学软件,对获得的鹰嘴豆LHY基因的核苷酸序列及编码的蛋白质序列进行分析;通过在线建模软件对蛋白质三维结构进行预测。经Blastn比对CiLHY基因cDNA序列与鹰嘴豆LHY-LIKE基因的相似度为99%,大豆的LHY基因的相似度为80%。构建类似蛋白系统进化树显示,与大豆(gi356573275;gi45685382)分子进化距离最近,其次是拟南芥(gi2699694251)、黑杨(gi219687745)。预测CiLHY蛋白不具有跨膜结构;为转录因子,定位于细胞核中;不具备信号肽。对CiLHY三级结构建模预测表明,蛋白质核心结构符合转录因子与DNA结合常见的功能域HTH。 (3)利用实时荧光定量PCR技术,用2-△△Ct方法进行CiLHY基因在光周期环境处理下的RNA的相对定量表达分析。结果表明,鹰嘴豆CiLHY的表达呈昼夜节律表达模式;不同光周期环境处理下,CiLHY的表达量变化幅度很大。在光照处理0h,CiLHY的表达水平为最高,之后的表达量开始降低,直到降到最低值即光照时间为16h;到24 h,又发现CiLHY的表达量水平又升到最高。而表达量水平的最高和最低值相差将近167倍。 (4)设计含有BglⅡ和NcoⅠ这两种限制性内切酶位点的鹰嘴豆CiLHY表达引物,扩增两端具有双酶切位点的CiLHY ORF全长,利用DNA重组技术,将获得的ORF全长片段插入用同样两种酶进行酶切的原核表达载体PET-28a,成功构建了生物节律钟基因CiLHY的原核表达载体PET-28a-CiLHY。