第一部分中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡制备及性能检测第一节 中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡制备及基本物理特征检测目的构建中性微泡(NMB)、阳离子微泡(CMB)及靶向阳离子微泡(CMB105),并检测其基本物理特征。方法采用机械震荡法构建三种不同脂质微泡,通过在成膜材料中加入DC-胆固醇(DC-cholesterol)使微泡表面带正电荷从而构建阳离子微泡(CMB),通过“生物素-亲和素”桥接法构建携抗CD105抗体的靶向阳离子微泡(CMB105),并同时构建携同型对照抗体微泡(C-CMB105),光镜下观察不同微泡基本形态,激光共聚焦显微镜证实抗体连接,并检测其浓度、粒径和表面电位等基本特性。健康裸鼠尾静脉注射不同类型微泡,检测其体内循环特征。结果NMB、CMB、CMB105及C-CMB105均成功构建,光镜下大小均一,分散度较好,激光共聚焦显微镜下链接经FITC标记二抗后的CMB105及C-CMB105显绿色荧光；CMB和CMB105的表面电位分别为26.44±2.13和26.62±2.48 mV,而NMB表面电位为-2.38±0.56mV,呈微弱负电荷。CMB, C-CMB105和CMB105的半衰期分别为8.35±1.27,7.63±1.61和7.27±1.33 min,而NMB的半衰期长于20min。结论NMB、CMB及CMB 105构建成功,表面连接抗体并不影响微泡表面电位及粒径。CMB和CMB105由于其表面带正电荷,体内半衰期时间短于NMB。第二节中性微泡、阳离子微泡、靶向阳离子微泡体外及体内靶向能力检测目的检测NMB、CMB、及CMB105体外及体内靶向表达CD105抗原的血管内皮细胞的能力。方法第一部分采用自行设计的特殊装置,将生长有脐静脉内皮细胞(HUVECs)的玻片先倒置与微泡充分孵育,再将其正置,倒置显微镜下计数与HUVECs靶向结合微泡数,检测不同微泡体外靶向的能力。第二部分皮下注射乳腺癌MDA-MB-231细胞株,建立人乳腺癌裸鼠模型,病理切片证实CD105表达于肿瘤新生血管内皮细胞。不同类型微泡经尾静脉注射,通过超声肿瘤成像,检测其体内靶向肿瘤新生血管能力。两部分实验中,C-CMB105作为CMB105同型对照而纳入实验分组中,竞争抑制实验被用于证实CMB105与靶细胞的特异性结合。结果体外实验中,除NMB之外,CMB、CMB105及C-CMB105均可与表达CD105抗原的HUVECs结合,而CMB105与HUVECs靶向结合数量最高(P<0.01),预先加入CD105抗体孵育后,CMB 105靶向细胞数目明显降低(P<0.01),而预先与同型对照抗体孵育时却没有影响(P>0.05)。体内实验中,除CMB105之外,NMB、CMB及C-CMB105均不能靶向表达CD105抗原的肿瘤新生血管内皮细胞。预先静脉注射抗CD105抗体后,与肿瘤新生血管内皮细胞靶向结合的CMB105显著降低(P<0.001)结论CMB、CMB105及C-CMB105均可与表达CD105抗原的HUVECs结合,但只有CMB105能与HUVECs靶向结合,而CMB与C-CMB105与HUVECs结合是通过细胞与带正电荷的微泡之间的电偶配对作用,这一优势在体内实验中不复存在,充分证实了CMB105主动靶向的能力。第二部分中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡体外转染HUVECs实验研究第一节中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡基因携载能力及超声转染后对HUVECs活性影响实验研究目的研究NMB、CMB、CMB105携载内皮抑素质粒(ES-GFP)能力及超声作用后对HUVECs活性影响。方法第一部分扩增抽提内皮抑素质粒(ES-GFP)并鉴定,将不同量(10,20,40, and 80μg)的质粒与微泡(5×108个)进行孵育,利用静电吸附原理使其充分结合,15分钟后离心洗涤,通过检测未结合的质粒量来计算与微泡结合的质粒量,并得出不同微泡质粒携载能力。第二部分是在超声作用下破坏NMB、CMB、CMB105,设空白组作为对照,通过FDA/PI双染色即时观察对细胞膜通透性影响,均为阳性则表示细胞膜通透性打开而同时细胞活性未受影响,并进一步行MTT检测,观察对细胞增殖活性影响。结果NMB、CMB、CMB105携载ES-GFP的能力分别是0.48±0.04μg,18.21±1.22μg和16.76±1.75 μg (per 5×108 microbubbles), CMB和CMB105的基因携载量无统计学差异(P>0.05)。FDA+/PI+阳性率在CMB105组最高(36.89±4.28%),与空白组(0.121±0.013%)、NMB组(6.19±2.35%)和CMB组(28.12±3.58%)相比差异均有统计学意义(P<0.01)。空白组、NMB组、CMB组、CMB105组各组细胞增殖活性分别为92.45±2.74%,90.63±2.52%,84.29±5.07%,77.38±5.33%,CMB组、CMB105组细胞增殖活性降低,组间比较差异亦具统计学意义。结论 由于表面带正电荷,CMB和CMB105基因携载能力明显提高,而表面携带抗体并不影响CMB105基因携载能力；与细胞结合微泡数量越多,其细胞膜通透性增加愈明显,而同时细胞增殖活性降低。第二节中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡携内皮抑素质粒超声作用下转染HUVECs的实验研究目的研究NMB、CMB、CMB105携内皮抑素质粒在超声作用下转染HUVECs细胞转染效率,以及对细胞周期、体外血管成型及肿瘤细胞侵袭的影响。方法实验分空白组、NMB组、CMB组、CMB105组四组,超声(1 MHz, 1 W/cm2, and 50% duty cycle (DC),30 seconds)作用下转染HUVECs,转染后收集细胞行流式细胞检测转染效率及细胞周期,qPCR及Western-blot分别检测Endostatin、VEGF、Caspase-3 mRNA及蛋白表达情况。通过体外血管成型及MDA-MB-231细胞侵袭评价ES质粒在不同微泡介导转染后治疗效果。结果转染后24小时各组转染效率分别为0.22±0.02%,1.36±0.13%,22.87±1.64%,33.60±2.02%,各组间差异具有统计学意义(P<0.01)；转染后24小时即可观察到在CMB和CMB105组,细胞周期抑制于G1期,48小时细胞周期抑制更加明显,CMB和CMB105组间差异具有统计学意义(P<0.01); qPCR和Western-blot均检测到在CMB和CMB105组Endostatin和Caspase-3 mRNA及蛋白表达增加,而VEGF mRNA及蛋白表达下降,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。在血管成型及肿瘤细胞侵袭实验中,各组血管官腔形成数目分别为：22.33±3.082、21.05±3.120、14.33±2.150、6.33±2.520,迁移肿瘤细胞数目分别为：67.33±5.06、64.72±5.38、34.33±3.22、25.17±2.84。结论CMB和CMB105组较对照组和NMB组转染效率明显提高,但CMB105组具有更高的转染效率及生物学效应,可明显抑制体外血管成型以及肿瘤细胞侵袭。第三部分中性微泡、阳离子微泡及靶向阳离子微泡转染治疗乳腺癌种植瘤实验研究目的研究NMB、CMB、CMB105携ES质粒在超声作用下转染MDA-MB-231细胞裸鼠种植瘤,观察其对肿瘤模型生长的影响及治疗作用。方法双后肢皮下注射MDA-MB-231细胞悬液建立种植瘤模型,造模后14天,NMB、CMB、CMB105携ES质粒在超声(1 MHz,2 W/cm2, and 50% DC,30 seconds)作用下转染肿瘤,左侧肿瘤接受治疗,右侧肿瘤做为对照。治疗前及治疗后每3天观察记录肿瘤生长情况,治疗后15天处死动物,剥取肿瘤计算抑瘤率,行TUNEL及PCNA观察肿瘤细胞凋亡及增殖状况。结果通过绘制肿瘤生长曲线,在转染后12天开始,CMB治疗组及CMB105治疗组肿瘤生长均受到抑制,转染后15天,NMB、CMB及CMB105各治疗组抑瘤率分别为：10.63±1.47%、27.57±3.02%、53.18±5.69%,CMB105携带ES质粒在超声作用下成功抑制肿瘤生长。三组的凋亡指数分别为：8.217±3.628%、25.06±5.721%、56.643士8.534%,增殖指数分别为：78.353±8.726%、50.98±6.142%、21.873±4.309%。结论携载ES质粒的CMB105在超声作用下其抗肿瘤治疗效应明显优于CMB及NMB,可在一定程度上延缓肿瘤生长。