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第一部分载脂蛋白E对神经元机械损伤后轴突再生修复的作用及机制研究目的:创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是神经外科的常见病之一,具有致死致残率高、预后不良的特点,如何改善其预后仍是目前治疗的重点和难点。神经传导通路的修复直接影响TBI的预后,其中轴突再生是神经修复的中心环节。载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)是神经系统最主要的载脂蛋白,已经证实能够改善TBI预后。本课题研究Apo E蛋白对TBI后神经元轴突再生修复的影响及机制,探讨其作为TBI治疗靶点的可能性。方法:1.培养APOE基因野生鼠和APOE基因敲除鼠的原代皮层神经元,利用移液器枪头划伤神经元的方法构建神经元机械损伤模型离体模拟TBI后的神经元损伤。1)将细胞分为APOE野生鼠组和APOE敲除鼠组,在损伤后24h,对神经元的新生轴突进行免疫荧光染色,观察伤后24h轴突再生的总长度;2)Western blot检测损伤后24h细胞内的衔接蛋白(Disabled-1,Dab1)磷酸化、轴突生长相关蛋白43(Growth associated protein 43,GAP43)的表达水平。2.构建沉默野生鼠神经元Dab1蛋白的Dab1 si RNA慢病毒载体(LV/Dab1 si RNA)。将神经元随机分为空载病毒组、LV/Dab1 si RNA-1、LV/Dab1 si RNA-2和LV/Dab1 si RNA-3组,在转染后72h,western blot检测各组Dab1蛋白的表达水平,筛选沉默效率最高的LV/Dab1 si RNA。3.通过LV/Dab1 si RNA沉默野生鼠神经元Dab1基因并构建神经元机械损伤模型。将神经元分为以下4组:(1)阴性对照组:阴性对照病毒感染神经元,没有给予机械损伤,同一时间点给予血清白蛋白(10μg/ml)作为对照;(2)阳性对照组:阴性对照病毒感染神经元,给予机械损伤,伤后给予等剂量的血清白蛋白;(3)Apo E蛋白治疗组:阴性对照病毒感染神经元,同样给予机械损伤,在伤后给予外源性重组Apo E蛋白(10μg/ml);(4)Apo E+LV/Dab1 si RNA组:LV/Dab1si RNA感染神经元,同样给予机械损伤,在伤后给予等剂量的Apo E蛋白。1)免疫荧光染色并观察各组伤后24h的再生轴突总长度、新生生长锥的数量和面积;2)Western blot检测损伤后24h各组细胞内的Dab1磷酸化、细胞分裂周期蛋白42(Cell division control protein 42,CDC42)活性以及GAP43蛋白的表达水平。结果:1.在神经元损伤后24h,APOE野生鼠组的轴突再生总长度显著高于APOE基因敲除鼠组;此时,APOE野生鼠组的Dab1磷酸化水平显著高于APOE基因敲除鼠组;APOE野生鼠组的GAP43表达水平也显著高于敲除鼠组。2.LV/Dab1 si RNA-1,LV/Dab1 si RNA-2和LV/Dab1 si RNA-3组的Dab1蛋白表达明显低于空载病毒组;LV/Dab1 si RNA-2组的Dab1蛋白表达水平最低。3.在神经元损伤后24h,Apo E蛋白治疗组的轴突再生长度、新生生长锥的数量和面积均明显高于没有给予Apo E蛋白的阳性对照组。4.在轴突再生修复的过程中,Apo E蛋白治疗组和阳性对照组的Dab1磷酸化、Cdc42活性和GAP43表达水平均显著高于没有神经元轴突再生修复的阴性对照组;同时,Apo E蛋白治疗组的Dab1磷酸化、Cdc42活性和GAP43表达水平均显著高于阳性对照组。5.在神经元损伤后24h,Dab1被沉默的Apo E+LV/Dab1 si RNA组的轴突再生长度、新生生长锥的数量和面积明显低于正常表达Dab1的Apo E蛋白治疗组;Apo E+LV/Dab1 si RNA组的Cdc42活性和GAP43表达水平也显著低于Apo E蛋白治疗组。结论:皮层神经元机械损伤后因为缺乏Apo E蛋白导致轴突再生修复受到抑制;而给予Apo E蛋白能够促进神经元的轴突再生修复。Apo E蛋白可能通过上调Dab1磷酸化,激活Cdc42活性,从而促进轴突再生修复,最终改善TBI的预后。第二部分载脂蛋白J对创伤性脑损伤的保护作用及机制研究目的:创伤性脑损伤的继发性病理生理损害包括氧化应激、炎症激活、血脑屏障破坏等,是影响病情的主要因素,但目前仍缺乏有效的干预手段。载脂蛋白J(Apolipoprotein J,Apo J)是中枢神经系统重要的载脂蛋白,已经证实在神经免疫和神经修复方面具有重要作用。本研究探讨Apo J蛋白对TBI的保护作用及相关机制,为TBI治疗提供潜在的有效治疗靶点。方法:1.在C57BL/6J小鼠建立控制性皮层撞击损伤模型(Controlled cortex impact,CCI)在体模拟TBI。Western blot检测Apo J蛋白在伤前、伤后6h,1d,3d,5d,7d,10d,14d,28d的表达变化。2.将小鼠随机分为假手术组、对照组和Apo J组。假手术组和对照组伤前给予100μl 5μg/m L血清白蛋白(BSA),Apo J组伤前侧脑室注射100μl 5μg/m L人重组Apo J蛋白。利用神经损伤评分(NSS评分)和水迷宫实验分别评估伤后小鼠的运动功能和认知功能的恢复情况。3.将小鼠随机分为假手术组、对照组和Apo J组,处理同上。在伤后24h,利用western blot检测伤灶周围脑组织的氧化应激标志物3-NT和4-HNE,补体反应产物C3b和C5b-9的表达水平;在伤后24h,利用PCR检测伤灶周围脑组织炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达水平;在伤后24h,组织免疫荧光检测伤灶周围的星型胶质细胞和小胶质细胞激活反应;在伤后7天,组织免疫荧光检测伤侧皮层和海马存活神经元的数量;在伤后24h,伊文思蓝染色检测双侧大脑半球的血脑屏障通透性,以及利用干湿重法检测双侧大脑半球的脑含水量。结果:1.Apo J蛋白在CCI伤后表达明显升高,在伤后6h表达最高,然后逐渐下降,伤后7天回到基值。2.NSS评分结果显示Apo J组的运动功能恢复显著优于对照组;两组的水迷宫实验结果没有显著差异。3.伤后24h,CCI组(即对照组和Apo J组)的氧化应激标志物3-NT和4-HNE显著高于假手术组,其中Apo J组的3-NT和4-HNE显著低于对照组;CCI组的补体激活产物C3b和C5b-9显著高于假手术组,其中Apo J组的补体途径终产物C5b-9显著低于对照组,但是Apo J组的C3b与对照组相比没有显著差异。4.伤后24h,CCI组IL-1β,IL-6和TNF-αm RNA水平显著高于假手术组,其中Apo J组的IL-1β和TNF-α显著低于对照组,但是IL-6与对照组相比没有显著差异。5.伤后24h,CCI组的星型胶质细胞和小胶质细胞激活数量显著高于假手术组,Apo J组的星形胶质细胞和小胶质细胞激活数量显著低于对照组;伤后7天,CCI组的皮层及海马神经元存活数量明显低于假手术组,其中Apo J组的皮层及海马区存活神经元数量显著高于对照组。6.伤后24h,CCI组的伤侧大脑半球血脑屏障通透性明显高于假手术组,其中Apo J组的血脑屏障通透性显著低于对照组;CCI组伤侧大脑半球含水量也明显高于假手术组,其中Apo J组的伤侧大脑半球含水量显著低于对照组。结论:Apo J蛋白可以改善小鼠TBI后的神经功能恢复。Apo J蛋白可能通过抗氧化应激、抑制神经炎症、降低脑水肿、保护神经元等综合作用促进TBI的神经功能修复,提示Apo J蛋白可能是TBI的一个潜在的治疗靶点。