研究背景阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的进行性神经退行性疾病,该病的主要表现为全脑不可逆性记忆功能损害,是公认的一种难治性疾病,其发病率和年龄的增长密切相关。AD的主要病理特征为细胞外β淀粉蛋白(β-amloid,Aβ)沉积和细胞内过量的Tau蛋白磷酸化形成神经纤维缠结(Neurogibrillary tangles,NFTs),从而导致突触功能障碍和神经元丢失等。囊泡转运是细胞中一个至关重要的过程,一旦囊泡转运系统不能正常工作,导致细胞内有害蛋白蓄积,蛋白溶酶体降解过程紊乱,最终导致认知损害等神经退行性疾病。研究目的本研究采用CRISPR/cas 9技术构建C57BL/6J背景的Vps4b+/-基因敲除小鼠模型,通过对小鼠行为学实验,评估基因敲除小鼠情感及认知能力的变化;进一步通过蛋白组学实验,确定基因敲除后与AD通路有关,通过小鼠脑组织AD相关蛋白表达的变化的验证,以及对神经元及突触可塑性等影响研究,以阐明Vps4b在小鼠认知损中扮演的角色及其具体致病机制。材料与方法通过小鼠行为学实验探索小鼠情绪及认知能力的变化。采用iTRAQ蛋白组学实验,检测Vps4b+/-小鼠脑组织蛋白差异表达情况,免疫印记技术验证差异表达蛋白;采用免疫荧光及免疫印记实验,探讨老年小鼠脑组织蛋白差异表达情况;进一步采用尼氏染色、高尔基染色探索小鼠神经元数目及突触可塑性变化;生物信息学预测VPS4B染色质相互区域。透射电镜观察脑组织多泡体、自噬体、溶酶体结构变化。结果小鼠旷场实验、黑白箱实验、高架迷宫实验结果显示Vps4b+/-较正常小鼠情绪更焦虑;三箱社交行为学实验、新事物识别实验,水迷宫实验结果显示Vps4b+/-,认知及记忆能力受损。iTRAQ蛋白组学结果显示Vps4b+/-小鼠AD相关通路蛋白表达明显上升,WB实验验证实验结果;免疫荧光及WB实验结构显示Vps4b+/-小鼠脑组织中App,Aβ40,Aβ42,P-Tau表达增多,Map2,Syp,Bc12表达减少;病理结果显示Vps4b+/-小鼠神经元数目减少,神经元分枝及树突棘较正常小鼠显著减少;生物信息学预测人的大脑皮层中VPS4B与BCL2染色质区域存在相互作用。透射电镜显性Vps4b+/-小鼠脑组织内囊泡运输受损,自噬体、溶酶体明显增多。结论Vps4b+/-基因敲除杂合子小鼠认知能力受损,其致病机制为Vps4b敲降引起App,Aβ40,Aβ42,P-Tau表达增多,Map2,Syp表达减少,从而导致小鼠脑组织神经元数目及结构受损,小鼠表现为记忆及认知功能受损。同时小鼠脑组织内囊泡运输受损,导致细胞内有害物质蓄积,也可导致神经退行性疾病。研究背景和目的成釉蛋白(Ameloblastin,AMBN)是一种参与釉质形成的蛋白质,并通过上皮间充质相互作用参与牙齿发育早期牙本质的形成。AMBN是釉质基质蛋白中含量仅次于釉原蛋白,在釉质形成过程中发挥重要的作用,AMBN突变可导致遗传性釉质发育不全,但AMBN突变导致牙本质异常至今尚未见报导。材料与方法以一个中国广东湛江的牙齿发育异常家系成员为研究对象,采集家系成员外周血和临床检查资料。采用Micro-CT及扫描电镜对脱落患牙超微结构进行分析。采用全外显子测序、Sanger测序技术以及家系共分离等方法,确定致病基因与突变位点并进行人群突变率筛查。采用Polyphen-2和I-TASSER分别对AMBN蛋白突变位点保守性和突变蛋白的三维构象变化情况进行预测。转染AMBN野生型和突变型真核表达载体至人源的HEK-293T细胞,比较野生型与突变型融合蛋白在细胞中亚细胞定位的差异,检测突变型AMBN在HGF细胞和HEK-293T细胞中mRNA和AMBN蛋白与野生型表达水平的差异。结果根据家系中患者情况我们绘制了该家系图谱,确定其为常染色体显性遗传牙釉质发育不全及牙本质发育异常疾病,可同时累及恒牙及乳牙。Micro-CT结果显示,患牙釉质及牙本质密度均比正常牙齿较低,髓腔内可见高密度钙化的髓石。SEM结果表明患牙釉质釉柱排列稀疏,偶尔可见无结构钙化区域,釉牙本质界缺少连续贝壳状的曲线,呈间隙增宽的直线状,牙本质小管分布不均,大小不一。对家系成员全基因组外显子测序、Sanger测序、STR连锁分析结果显示,家系患病成员AMBN基因13号外显子(c.1069C>T),致病突变家系出现共分离,且人群中未发现该突变。蛋白结构及有害性预测分析结果显示位于AMBN蛋白357位点在多个物种中为保高度守位点,突变后蛋白三维结构发生改变,且为有害性改变。亚细胞定位结果显示野生型及突变型AMBN融合蛋白均定位于胞浆中。qRT-PCR检测结果显示突变AMBN基因mRNA相对表达量与野生型无差异,但突变后蛋白表达水平显著高于野生型蛋白(P<0.001)。结论本实验首次发现AMBN(c.1069C>T)突变导致牙齿釉质发育不全合并牙本质发育异常。牙齿矿化不良,超微结构改变。新的突变位点在AMBN蛋白序列中具有高度保守性,导致蛋白三维构象发生改变,为有害突变,突变后蛋白表达量增加。本研究表明AMBN对牙釉质及牙本质发育具有重要作用。