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植物非特异性转脂蛋白(nsLTP)是一类广泛存在于高等植物中的碱性小分子蛋白。早期体外试验发现,它们能与脂肪酸结合,并增强膜结构之间的脂分子转移。后来的研究表明,转脂蛋白参与了植物角质层的形成,以及针对生物和非生物胁迫的应答等生理过程。目前,其准确的生物学功能仍在争论之中,有关转脂蛋白功能调节的信息更是缺乏。
蛋白质的可逆磷酸化修饰是真核生物细胞生命活动调节中最常见的一种机制。本研究组曾从中国大白菜中分离了一种分子量约为10 kDa的钙调素结合蛋白,暂名CaMBP10(简称 BP10),并已证实BP10是植物非特异性转脂蛋白家族的一员。本论文以白菜为实验材料,研究了白菜内源蛋白激酶对非特异性转脂蛋白BP10的磷酸化修饰,探讨蛋白质磷酸化对转脂蛋白功能的调节作用。
采用差速离心法,制备了白菜的胞浆可溶性蛋白和膜蛋白分别作为可溶性蛋白激酶和膜蛋白激酶的来源。利用同位素标记法,我们分别研究了白菜可溶性蛋白激酶和膜蛋白激酶磷酸化BP10的生化特征。磷酸化时间曲线和免疫印迹分析表明:白菜胞浆中存在内源的可溶性蛋白激酶磷酸化BP10。进一步研究发现,BP10的磷酸化依赖于Ca2+,而Ca2+的鳌合剂EGTA、CaM的拮抗剂W7和TFP能够抑制胞浆激酶对BP10的磷酸化。In-gel kinase分析表明:一分子量约为45 kDa的蛋白激酶自磷酸化后能够原位磷酸化:BP10和组蛋白H1。该45 kDa激酶自磷酸化和底物磷酸化均依赖于Ca2+,它磷酸化BP10 C-末端CaM结合结构域内的83、85位丝氨酸(Ser)残基或86位苏氨酸(Thr)残基。综合上述,我们确认45 kDa蛋白激酶是植物钙依赖性蛋白激酶(CDPK)家族的成员,而BP10是CDPK的内源特异性底物。CaM凝胶覆盖分析表明,CDPK激酶对BP10的磷酸化抑制了BP10与CaM的结合,暗示CDPK可能参与转脂蛋白(BP10)功能的调节。为了探讨nsLTP磷酸化后对其脂质结合活性的影响,我们将83、85位Ser突变为天门冬氨酸(Asp),实验结果显示,与野生型BP10相比,突变体Ser83D/Ser85D脂质结合能力明显增强。采用植物激素茉莉酸(JA)处理白菜后,BP10的磷酸化水平降低,而RT-PCR显示BP10的表达水平上调。因此,茉莉酸信号通路可直接在转录水平调节nsLTP的表达,也可间接影响nsLTP的磷酸化修饰,从而调控nsLTP功能。另一方面,我们在膜蛋白体系内同样发现了磷酸化BP10的激酶。膜蛋白激酶对BP10的磷酸化受Ca2+,EGTA,W7的影响,说明存在膜结合的CDPK磷酸化BP10。膜激酶的高活性依赖于膜结构的完整性。磷酸化位点分析表明80位的酪氨酸是磷酸化的氨基酸之一,说明存在其他类型的膜蛋白激酶磷酸化BP10。进一步实验表明,膜蛋白激酶对BP10的磷酸化同样造成BP10结合CaM能力减弱。采用JA处理白菜后,实验结果显示,JA单独不能影响BP10磷酸化水平,而JA-LTP的复合物使得BP10的磷酸化在处理后12 h达到高峰。由此,我们推测BP10在体内可能具有多种生理功能,并且受到不同细胞区域内蛋白激酶的调节而产生相应的生物学效应。本研究对于探索转脂蛋白功能及其功能的调节机制提供了新线索。