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类胡萝卜素是植物中常见的色素类物质,它在植物中能发挥重要的作用,对人体也有许多益处。柿作为我国水果市场上常见且深受消费者喜爱的水果之一,其果实中含有丰富的类胡萝卜素,但柿类胡萝卜素合成途径中的基因功能研究较少。本试验以不同生长发育和采后贮藏时期的‘黑柿’和‘火罐’果实为材料,分析柿果实生长发育和成熟软化过程中果实硬度、可溶性固形物含量、单宁含量和果肉颜色的变化,用HPLC分析果肉中类胡萝卜素含量变化,用q RT-PCR分析类胡萝卜素合成相关基因的表达量变化。并以盛花期后165天的‘黑柿’果肉c DNA为模板克隆DkPSY和DkLCYb基因,通过瞬时转化番茄验证DkPSY的功能,通过在工程菌中原核表达和瞬时转化柿果实验证DkLCYb的功能。主要研究结果如下:1、柿果实生长发育和成熟软化过程中品质的变化。果肉硬度持续降低,尤其是采后贮藏中后期硬度大幅降低。果实生长发育期间果肉中可溶性固形物含量均先降低再升高,采后成熟软化期间‘黑柿’中可溶性固形物含量持续降低,‘火罐’中可溶性固形物含量先降低再略微升高。果实生长发育和成熟软化期间果肉中可溶性单宁含量逐渐降低,不溶性单宁含量在生长期降低,采后成熟软化期间持续增加,在果实成熟软化最后一个时期果肉中可溶性单宁含量骤降至0.5%以下,不溶性单宁含量骤升,果实达到可食用标准。柿果实生长发育期间果肉由绿转黄,颜色丰富度增加,采后成熟软化期间果肉逐渐转橙,‘黑柿’果肉在采后贮藏第20天时颜色最丰富,‘火罐’果肉在采后贮藏第0天时颜色最丰富。果实成熟软化末期‘黑柿’果肉为橙黄色,‘火罐’果肉为橙红色。2、柿果实生长发育和成熟软化过程中类胡萝卜素含量的变化。采用非皂化方法提取并分析柿果实类胡萝卜素积累特征,结果表明随着柿果实生长发育和成熟软化过程的发生,‘黑柿’和‘火罐’果肉中的类胡萝卜素逐渐积累。柿果肉中最主要的类胡萝卜素成分为番茄红素和β-胡萝卜素,‘黑柿’中β-胡萝卜素含量最高,‘火罐’中番茄红素含量最高,两个品种柿果实果肉均只含有微量的玉米黄质、β-隐黄质和α-胡萝卜素。3、柿果实生长发育和成熟软化过程中类胡萝卜素合成相关基因表达分析。q RT-PCR分析表明类胡萝卜素合成相关基因DkPSY、DkPDS、DkZDS、DkLCYb、DkLCYe和DkBCH在柿果实生长发育和成熟软化前期表达量持续增加,到成熟软化后期开始表达水平显著降低。柿果实果肉类胡萝卜素含量受DkPSY和DkLCYb影响较大,柿果实中番茄红素主要由β,β分支进行转化。4、柿果实DkPSY和DkLCYb基因功能分析。克隆的DkPSY基因c DNA序列全长1308 bp,编码435个氨基酸。在番茄中转化DkPSY证明其能有效地调控类胡萝卜素的合成和积累。过表达DkPSY可以增加番茄中番茄红素、玉米黄质和α-胡萝卜素的含量,沉默DkPSY基因可以显著降低番茄中番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质和α-胡萝卜素的含量。克隆的DkLCYb基因c DNA序列全长1515 bp,编码503个氨基酸。在大肠杆菌工程菌和柿果实中转化DkLCYb表明其能促进番茄红素向β-胡萝卜素转化。DkLCYb在工程菌中表达能降低工程菌中番茄红素含量并生成β-胡萝卜素,过表达DkLCYb能显著降低柿果肉中番茄红素含量,同时增加了β-胡萝卜素含量。