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研究背景与目的乳腺癌(breast cancer)是全球范围内女性发病率最高和最常见的恶性肿瘤,严重危害女性的生命健康[1]。在乳腺癌不同亚型里,HER2阳性乳腺癌是一类人表皮生长因子受体 2(human epidermal growth factor receptor2,HER2)过度表达或扩增的乳腺癌,约占所有乳腺癌的15～20%,其有着独特的临床特点和生物学行为,进展快,预后差[2,3]。尽管大量的临床试验奠定了曲妥珠单抗的一线治疗地位,但接受曲妥珠单抗治疗后一年有高达62%的患者发生了原发或继发性耐药[4-6],因此,寻找新的治疗策略,对提高HER2 阳性乳腺癌患者预后至关重要。其中c-Src是人类第一个命名的癌基因,它编码的Src蛋白,属于酪氨酸激酶家族成员,在多种肿瘤中都高表达,参与肿瘤细胞的生长、侵袭及转移等多条信号通路,与肿瘤的发生发展密切相关[7,8]。在大约60%的乳腺癌中,Src蛋白表达显著升高,且伴随异常活化[9]。因此,近年来Src激酶被视为乳腺癌治疗的一个新兴靶点[10,11]。塞卡替尼作为Src激酶选择性抑制剂,体内外实验均发现它可以有效的抑制乳腺癌细胞的生长[12,13]。最新研究结果显示,塞卡替尼可以在一定程度上逆转肿瘤细胞对氟维司群、曲妥珠单抗、拉帕替尼和吉西他滨等药物的耐药表型,这更加凸显了塞卡替尼的临床运用价值[14-17]。但是已有的临床研究发现塞卡替尼在激素受体阴性的乳腺癌中疗效并不理想,药物耐药可能是导致Src抑制剂疗效不佳最主要的原因,但其具体耐药机制很不清楚[18,19]。研究其耐药机制并探寻可行的调节靶点,已成为临床HER2阳性乳腺癌治疗中面临的巨大挑战和亟待解决的关键性课题。基于前期的工作基础,本研究首先选取HER2阳性乳腺癌细胞(SKBR-3)建立塞卡替尼耐药株,利用体内、外模型,探讨Src抑制剂可能的耐药机制,同时也为临床逆转HER2阳性乳腺癌耐药提供新的治疗方法和可行策略。材料与方法本研究选取HER2阳性乳腺癌细胞SKBR-3和耐Src抑制剂(塞卡替尼)细胞株SKBR-3/SI为研究对象。1.建立人乳腺癌耐Src抑制剂塞卡替尼细胞株(SKBR-3/SI),通过CCK8、克隆形成、流氏细胞术和蛋白免疫印迹等实验对其耐药性和生物学特性进行验证。2.分析SKBR-3和SKBR-3/SI细胞的mRNA表达谱。表达变化2倍及以上的过滤标准筛选SKBR-3和SKBR-3/SI的差异mRNA,进行GO功能分析得出SKBR-3和SKBR-3/SI差异表达基因的富集通路,筛选并确定目标mRNA(PAI-1),利用定量即时聚合酶链锁反应和蛋白免疫印迹实验对其进行验证。3.通过CCK8、克隆形成、流氏细胞术和细胞迁移实验探究目标mRNA(PAI-1)在细胞水平上对塞卡替尼敏感性(IC50)以及对细胞增殖、凋亡、侵袭能力等方面的影响。4.结合mRNA表达谱、课题组前期研究成果和文献报道,寻找PAI-1导致Src抑制剂耐药的具体调控分子(CCL5),利用PAI-1因子和PAI-1拮抗剂PAI-039以及PAI-1的小干扰RNA探究PAI-1对CCL5表达的影响。5.通过CCK8、克隆形成、流氏细胞术、划痕实验和细胞迁移实验探究CCL5对塞卡替尼敏感性以及对细胞增殖、凋亡、迁移能力等方面的影响。6.收集运用SKBR-3和SKBR-3/SI细胞构建裸鼠皮下移植瘤模型,绘制肿瘤重量曲线,并通过免疫组化染色检测PAI-1、CCL5和Ki67的表达差异,分析其相关性。结果1.Src抑制剂塞卡替尼显著抑制HER2阳性乳腺癌细胞株SKBR-3的增殖能力,促进细胞凋亡;而对耐药株SKBR-3/SI的增殖和凋亡没有影响,且耐药细胞株稳定增殖;乳腺癌耐药蛋白(BCRP/ABCG2)在耐药株SKBR-3/SI中高表达(*P<0.05),表明耐塞卡替尼细胞株SKBR-3/SI成功建立。2.与SKBR-3相比,PAI-1在SKBR-3/SI中表达上调(上调倍数为2.4426);PAI-1/CCL5 介导的 positive regulation of monocyte chemotaxis 信号通路富集显著。3.人重组PAI-1(rPAI-1)能够提高细胞对塞卡替尼的敏感性(IC50值:SKBR-3为5.004,SKBR-3+rPAI-1为6.827,**P<0.01),促进细胞增殖和迁移能力;而PAI-1抑制剂PAI-039降低细胞对塞卡替尼的敏感性(IC50值:SKBR-3/SI 为 11.14,SKBR-3/SI+PAI-039 为 8.092,**P<0.01),抑制细胞增殖和迁移能力。4.CCL5在SKBR-3/SI中表达上调(上调倍数为4.4684)。人重组PAI-1因子rPAI-1促进HER2阳性乳腺癌细胞分泌CCL5,PAI-1抑制剂PAI-039和PAI-1的小干扰RNA(siPAI-1)抑制HER2阳性乳腺癌细胞分泌CCL5。5.CCL5因子可以提高细胞对塞卡替尼的敏感性(IC50值:SKBR-3为5.004,SKBR-3+CCL5为6.827,**P<0.01),促进细胞增殖和迁移能力;CCL5中和抗体CCL5 ab可以降低细胞对塞卡替尼的敏感性(IC50值:SKBR-3/SI为11.14,SKBR-3/SI+CCL5 ab为8.082,**P<0.01),抑制细胞增殖和迁移能力。6.通过SKBR-3和SKBR-3/SI构建的裸鼠皮下移植瘤模型发现SKBR-3/SI组的肿瘤肿瘤组织体积更大,重量更重,免疫组化结果显示PAI-1/CCL5在SKBR-3/SI组中表达水平更高,PAI-1表达与CCL5表达存在明显的一致性,而且SKBR-3/SI组Ki67表达更高,表明SKBR-3/SI组肿瘤恶性程度更高。结论综上所述,本研究证明了 PAI-1过表达可以促进CCL5的分泌,提高细胞对Src抑制剂塞卡替尼的IC50,最终诱导HER2阳性乳腺癌细胞对Src抑制剂塞卡替尼产生耐药,并促进细胞增殖和迁移能力。同时,实验表明在HER2阳性乳腺癌细胞中,Src抑制剂联合PAI-1抑制剂或者CCL5中和抗体可以在一定程度上逆转耐药,为临床HER2阳性乳腺癌患者的潜在治疗策略提供了理论基础。