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低碱性磷酸酯酶症（Hypophosphatasia，HPP）是一种由ALPL基因突变引起的遗传性系统性疾病，因其编码的非组织特异性碱性磷酸酶（Tissue nonspecific alkalinephosphatase，TNAP）活性降低从而表现出骨骼及牙齿硬组织发育不良，以及血清碱性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）活性偏低。ALP的高表达是成骨细胞分化的特异性标志，对骨骼的发育起到关键作用。目前对HPP发病机制的研究尚不深入。因此，探索由ALPL基因突变导致的细胞及分子学变化的机制对于深入理解HPP致病机理和提供新的治疗思路具有重要的意义。骨髓间充质干细胞（Bone marrowmesenchymal stem cells，BMMSCs）在整个骨组织的发育、改建和骨折修复中发挥了非常重要的作用。因此，HPP患者来源的BMMSCs可以作为研究该疾病的最佳模型。本研究对3名HPP患儿进行临床、实验室检查和遗传学诊断，并观察Akp2敲除小鼠骨骼发育状况，证明ALPL基因突变对骨骼发育的影响；进而对2名HPP患儿及正常同龄儿童的BMMSCs进行体外培养及生物学特性的检测，明确HPP患儿BMMSCs的异常表现；利用表达谱芯片检测，首次发现正常和HPP患儿BMMSCs中与成骨分化关系密切的差异基因ADRB2；进一步通过对正常儿童及HPP患儿BMMSCs进行ALPL基因表达调控，首次证明在BMMSCs成骨分化过程中ALPL对ADRB2具有负向调控作用；最后分别对正常儿童及HPP患儿BMMSCs中ADRB2进行基因表达调控，证实ADRB2对BMMSCs成骨分化的作用。本课题研究内容分以下四部分：第一部分ALPL基因突变导致成骨发育不全的检测目的：明确ALPL基因突变情况下骨组织的发育异常表现。材料与方法：对3名患儿进行临床、实验室检查和遗传学分析，做出明确诊断并证明HPP患儿的成骨发育不全表型；进而通过对Akp2+/-小鼠骨组织结构进行病理学观察，明确ALPL基因突变情况下骨组织的发育异常表现。结果：3名患儿均表现为血清ALP活性降低，长骨的密度及强度不足，牙根发育不良以及牙齿过早脱落。遗传学分析发现3名患儿均存在ALPL基因突变，由此可将3名患儿确诊为儿童型低碱性磷酸酯酶症；组织学观察显示，Akp2+/-小鼠骨骼发育上存在缺陷，胫骨结构异常。结论：3名患儿均为儿童型低碱性磷酸酯酶症，均存在骨组织发育不全表型，而Akp2+/-小鼠也存在骨发育异常，从而证明ALPL基因突变可导致骨骼发育异常。第二部分HPP患儿BMMSCs的生物学特性研究目的：探索HPP患儿BMMSCs的异常生物学行为与基因表达，为HPP的致病机制提供分子水平证据。材料与方法：对2名HPP患儿及正常同龄儿童BMMSCs进行分离培养及鉴定，并对其进行生物学特性的检测；利用全基因组表达谱芯片检测正常和HPP患儿BMMSCs成骨诱导分化前后的基因表达情况，筛选正常和HPP患儿BMMSCs成骨分化相关的差异基因。结果：体外培养获得的2名HPP患儿及正常同龄儿童BMMSCs均为间充质来源的干细胞，均具有多向分化能力，HPP患儿来源BMMSCs增殖能力与成骨分化能力较正常同龄儿童显著降低；通过全基因组芯片的筛选与验证，发现ADRB2基因表达在正常和HPP患儿BMMSCs成骨分化中存在显著差异。结论：ALPL基因突变可导致BMMSCs成骨分化能力减弱，并且在ALPL突变的情况下，ADRB2基因在成骨过程中的表达发生显著改变。第三部分BMMSCs成骨分化中ALPL对ADRB2影响的实验研究目的：证明ALPL基因对BMMSCs成骨分化能力及ADRB2基因表达的影响。材料与方法：分别对正常儿童及HPP患儿BMMSCs的ALPL基因进行沉默/过表达，并对调控后的细胞进行成骨分化能力和ADRB2基因的表达情况进行检测。结果：干扰正常儿童BMMSCs中ALPL基因表达后，细胞的成骨能力显著下降，且在成骨过程中，ADRB2的变化程度也减弱；过表达HPP患儿BMMSCs的ALPL基因可以改善患者细胞的成骨能力，并且在成骨过程中对ADRB2起到下调作用。结论：ALPL基因对BMMSCs成骨分化具有促进作用，而对ADRB2的表达具有负向调控能力。第四部分ADRB2在BMMSCs成骨分化中的作用研究目的：证明ADRB2在BMMSCs成骨分化中的作用。材料与方法：首先将HPP患儿的BMMSCs进行ADRB2基因沉默，并对细胞成骨能力进行检测；进而将正常儿童BMMSCs进行ADRB2基因过表达，同样检测细胞成骨能力的改变。结果：干扰HPP患儿BMMSCs中ADRB2基因表达后，细胞成骨能力得到显著改善，但ADRB2的变化不会引起ALP活性及其基因和蛋白表达水平的改变；过表达正常BMMSCs中ADRB2基因后，细胞成骨能力显著降低，并且ADRB2表达水平的上调也不会影响ALP活性及基因和蛋白水平的表达。结论：ADRB2具有抑制BMMSCs成骨分化的作用。