研究背景中国是一个肺结核高负担的国家,肺结核发病率在世界排名第二,仅次于印度。肺结核具有传染性,当人吸入含有结核分枝杆菌的微滴就可能感染结核菌。糖尿病患者免疫力低下,更容易感染结核菌。糖尿病的发病率逐年升高,2011年中日友好医院杨文英教授的流行病学调查指出糖尿病的患病率是9.7%,糖尿病前期的患病率为15.5%。糖尿病增加肺结核的防控难度,糖尿病中肺结核的患病率约占10%-15%,较正常人群高3-6倍,糖尿病合并肺结核需要引起重视。目前糖尿病和肺结核的双向筛查还没有相关结果发布。糖尿病和肺结核这两种共存的疾病都和免疫系统相关,阐明糖尿病合并肺结核患者的免疫状况非常必要。维生素D是一种调节钙磷代谢的激素前体,现代研究发现活性维生素D具有免疫调节作用。活性维生素D通过与免疫细胞的受体结合改变免疫细胞的表型和功能,抑制过激的免疫反应。活性维生素D与其受体结合后还可以产生LL-37(人内源性抗菌肽),LL-37具有清除结核菌的能力。目前没有关于糖尿病合并肺结核患者体内维生素D和LL-37水平的研究,阐明此问题将对维生素D在糖尿病合并肺结核患者的辅助治疗提供理论依据。T细胞免疫在肺结核的发病机制中占有重要的地位,T细胞包括多个T细胞亚群,产生多种细胞因子,组成复杂而功能强大的细胞因子网络。细胞因子的免疫调控对于预防和治疗结核病具有重要意义。它们在糖尿病合并肺结核患者中以何种水平存在,如何相互影响,尚不清楚。阐明细胞因子在这一特殊感染人群的水平将对糖尿病合并肺结核患者的免疫治疗提供理论基础。本研究采用准确先进的液相色谱-串联质谱法测定血清25羟维生素D3的水平,反映体内维生素D的状态；应用固相酶联免疫吸附法测定血浆LL-37的水平；通过流式细胞仪测定一系列细胞因子的水平,旨在明确糖尿病合并肺结核患者这一特殊人群维生素D,LL-37和细胞因子的水平,阐明上述因素对糖尿病合并肺结核疾病的影响和相互关系,为将来糖尿病合并肺结核的防治提供理论依据。第一部分维生素D、LL-37在糖尿病合并肺结核患者的水平研究目的1.明确糖尿病合并肺结核患者体内维生素D和LL-37的水平。2.阐明糖尿病合并肺结核患者的临床特点。3.讨论维生素D和LL-37对糖尿病合并肺结核疾病的影响。方法1.研究对象选自山东省胸科医院的住院患者和院内健康的工作人员,分为三组：正常对照组(normal control, NC),肺结核组(pulmonary tuberculosis, PTB)和糖尿病合并肺结核组(diabetes mellitus with pulmonary tuberculosis, DMPTB)。NC组：健康的院内工作人员30例；PTB组：初治肺结核患者30例；DMPTB组：初治糖尿病合并肺结核患者30例。2.采集研究对象的血清和血浆标本,应用液相色谱-串联质谱法测定血清25羟维生素D3水平；应用固相酶联免疫吸附法测定血浆LL-37的水平；同时进行空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、血常规、免疫功能、PPD试验、痰抗酸杆菌涂片,痰结核菌培养和胸部CT等检查。数据应用SPSS14.0软件进行统计分析：采用方差分析进行组间比较,Pearson相关分析进行相关性分析。结果1.研究对象血清25羟维生素D3和血浆LL-37的水平1)血清25羟维生素D3:DMPTB组(11.36±4.85ng/ml)及PTB组(12.04±6.08ng/ml)明显低于NC组(17.49±7.50ng/ml)(P<0.01)。DMPTB组和PTB组两者之间差别没有统计学意义(P>0.05)。2)血浆LL-37:DMPTB组(57.52±34.17ng/ml)和PTB组(44.53±16.88ng/ml)明显高于NC组(32.20±10.14ng/ml)(P<0.01)。DMPTB组和PTB组两者之间差别没有统计学意义(P>0.05)。2.研究对象的临床特点1)空腹血糖、HbAlc和中性粒细胞的水平DMPTB组的FBG、HbA1c(%).中性粒细胞(11.05±3.62mmol/L;8.63±2.35;5.48±2.60*109/L)明显高于PTB组(4.80±0.54mmol/L;5.25±0.27;4.77±2.52*109/L)和NC组(4.73±0.55mmol/L;5.28±0.29；4.06±0.99*109/L)(P<0.05)。PTB组和NC组的FBG、HbA1c和中性粒细胞的水平没有统计学差别(P>0.05)。2)PPD试验直径、免疫功能CD4+T细胞的水平NC组PPD试验直径(11.17±5.78cm)明显低于PTB组(17.98±5.98cm)和DMPTB组(16.33±4.76cm)(P<0.05)。CD4+T细胞比例(%)在PTB组(35.86±8.07)和DMPTB组(35.16±8.85)两组的水平明显低于NC组(48.55±1.61)(P<0.05)。PTB组和DMPTB组两组之间的PPD试验直径、CD4+T细胞比例无统计学差别(P>0.05)。3.PTB组和DMPTB组痰和影像学结果DMPTB组的痰抗酸杆菌涂片阳性率(15/30,50%),痰结核菌培养阳性率(18/30,60%),胸部CT空洞的发生率(19/30,63.3%)明显高于PTB组(7/30,23.3%；9/30,30%；6/30,20%)(P<0.05)。4.相关分析FBG与HbA1c(r=0.84,P=0.000),与LL-37(r=0.304,P=0.004)呈正相关关系。CD4+T细胞比例与25羟维生素D3呈正相关关系(r=0.246,P=0.020)；与HbA1c, LL-37呈负相关关系(r=-0.229, P=0.030;r=-0.495, P=0.000)。PPD试验直径与LL-37具有正相关关系(r=0.262,P=0.013)。结论1.糖尿病合并肺结核患者具有较高的中性粒细胞和LL-37水平,较低的CD4+T细胞比例,容易排菌和产生空洞。2.糖尿病合并肺结核患者存在维生素D缺乏,提示补充维生素D可能有益。3.LL-37可作为结核病的生物标记物。第二部分细胞因子在糖尿病合并肺结核患者的水平研究目的1.阐明糖尿病合并肺结核患者一系列T细胞因子的水平。2.分析多个细胞因子对糖尿病合并肺结核疾病的影响。方法研究对象、标本采集和统计分析同第一部分,应用流式细胞仪测定血清中一系列T细胞因子的水平。结果1.Th1细胞因子(IFN-γ, IL-2和IL-12)水平1) DMPTB组和PTB组的血清IFN-γ水平(17.43±29.90pg/ml;12.23±11.18pg/ml)明显高于NC组(2.09±4.66pg/ml)(P<0.05)。DMPTB组和PTB组的血清IFN-y水平差别没有统计学意义(P>0.05)。2) DMPTB组的血清IL-2水平(62.18±52.15pg/ml)明显高于PTB组(36.81±35.56pg/ml)和NC组(27.07±32.52pg/ml)(P<0.05), PTB;组和NC组的血清IL-2水平没有统计学差别(P>0.05)。3)NC组、PTB组和DMPTB组三组之间的血清IL-12p70水平(4.09±5.99pg/ml;6.67±8.61pg/ml;8.29±13.41pg/ml)无统计学差异(P>0.05)。2.Th2细胞因子(IL-4, IL-5, IL-10和IL-13)水平1)血清IL-4, IL-10和IL-13水平在DMPTB组(58.18±58.96pg/ml;11.39±11.53pg/ml;49.56±63.31pg/ml)及PTB组(38.37±28.98pg/ml;9.03±6.36pg/ml;31.49±22.45pg/ml)明显高于NC组(14.72±18.86pg/ml;5.05±5.77pg/ml;15.77±19.21pg/ml)(P<0.05)。DMPTB组和PTB组两组之间的IL-4, IL-10和IL-13的水平没有统计学差别(P>0.05)。2)NC组,PTB组和DMPTB三组之间的血清IL-5水平(5.47±6.86pg/ml;9.96±10.19pg/ml;9.57±12.67pg/ml)无统计学差异(P>0.05)。3. Th9,Th17和Th22(IL-9, IL-17A和IL-22)细胞因子水平1)血清IL-9和IL-17A水平在DMPTB组(12.42±24.00pg/ml;42.24±67.70pg/ml)及PTB组(6.30±11.03pg/ml;31.56±19.07pg/ml)明显高于NC组(0.68±0.64pg/ml;9.33±8.15pg/ml)(P<0.05)。DMPTB组和PTB组两组之间的IL-9, IL-17A水平差别没有统计学意义(P>0.05)。2)NC组血清IL-22的水平(677.01±538.24pg/ml)明显高于PTB组(391.33±264.66pg/ml)及DMPTB组(407.23±345.98pg/ml)(P<0.01)。PTB和DMPTB两组之间的血清IL-22的水平差别无统计学意义(P>0.05)。4.前炎症细胞因子(IL-1β,IL-6和TNF-α)水平1)血清TNF-α的水平在DMPTB组(13.49±20.28pg/ml)及PTB组(11.51±10.95pg/ml)明显高于NC组(1.69±3.12pg/ml)(P<0.05)。DMPTB组和PTB组两组之间TNF-a水平差别没有统计学意义(P>0.05)。2) DMPTB组的血清IL-6水平最高(53.12±98.50pg/ml), PTB组其次(5.16±4.03pg/ml), NC组最低(1.36±2.33pg/ml),两两比较差别具有统计学意义(P<0.05)。3)NC组,PTB组和DMPTB组三组之间的血清IL-1p水平(3.75±7.23pg/ml;11.07±11.45pg/ml;28.81±85.96pg/ml)无统计学差异(P>0.05)。5.相关分析1)临床特征与细胞因子的相关关系正相关关系CD4+T细胞比例与IL-22呈正相关(r=0.217,P=0.040)。HbAlc与IL-4,IL-6,IL-13,IL-17A,IFN-γ呈正相关(r=0.398,P=0.040；r=0.237,P=0.024;r=0.320,P=0.002;r=0.274,P=0.009;r=0.311,P=0.003)。PPD与IL-4,IL-10和IL-17A呈正相关(]=0.222,P=0.036;r=0.213,P=0.044;r=0.210,P=0.047)。负相关关系25羟维生素D3与IL-13呈负相关(r=-0.234,P=0.027)。2)细胞因子之间的相关关系IFN-y与IL-4,IL-9和IL-17A呈正相关关系(r=0.641,P=0.000；r=0.301,P=0.004；r=0.796,P=0.000)。IL-4与IL-9.IL-17A呈正相关关系(r=0.246,P=0.019;r=0.608, P=0.000)。IL-9与IL-6呈正相关(r=0.215,P=0.042)。IL-10与IL-2,IL-13,TNF-a呈正相关(r=0.248,P=0.018;r=0.238,P=0.024;r=0.420,P=0.000)。结论1. Th1、Th2、Th9、Th17、Th22细胞因子和前炎症细胞因子参与肺结核的发生和发展。2.IL-9和IL-17可作为结核病诊断新的血清学标志物。3.IL-2和IL-6是鉴别糖尿病肺结核和非糖尿病肺结核的重要细胞因子。4.糖尿病合并肺结核后Thl与Th2细胞因子增强,Th1细胞因子的代偿不足以阻止肺结核的发生。5.维生素D缺乏和血糖控制不佳导致Th2细胞因子增强,CD4+T细胞比例降低,保护性细胞因子IL-22水平下降。6.IL-22将来可能成为一个新的抗结核辅助治疗方式。课题的创新性及意义1.在国内外首次观察糖尿病合并肺结核患者维生素D、LL-37的水平。2.糖尿病肺结核患者的维生素D测定采用准确先进的液相色谱-串联质谱法。3.在国内外首次应用流式细胞仪阐明糖尿病合并肺结核患者一系列T辅助细胞因子的水平。4.在国内外首次研究糖尿病合并肺结核患者维生素D、LL-37与T细胞因子免疫的关系,为维生素D将来应用于糖尿病合并肺结核患者这一特殊人群的辅助治疗提供理论依据。