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猪链球菌(Streptococcus suis,S.suis)是一种重要的人畜共患病原菌,可引起猪和人的感染,表现为脑膜炎、败血症、关节炎和心内膜炎等。在33个血清型中,猪链球菌2型(Streptococcus suis type2,SS2)流行最广,致病性最强,危害最重,给养殖业造成了巨大的经济损失,并危害公共卫生安全。细菌在感染的过程中,需要感知复杂多变的宿主体内环境,调节各种相关基因的表达,以达到在宿主体内生存、繁殖和致病的目的。转录调节因子是细菌应对动态环境的一个重要机制。Rex是一种广谱转录调节因子,在细菌的生存过程中起重要作用。本文对转录调控因子Rex在SS2生存致病过程中的作用进行了研究。1、猪链球菌2型转录调控因子Rex原核表达及体外结合活性分析克隆猪链球菌2型转录调控因子Rex的编码基因进行原核表达和纯化,对其进行生物信息学分析和体外结合活性测定。PCR扩增猪链球菌2型强毒株SS2-1的Rex基因编码区,将其克隆入pET28a质粒中,再将pET28a-Rex重组质粒转入大肠杆菌表达菌BL21(DE3)中,重组菌株经IPTG诱导后表达出猪链球菌Rex蛋白(SsRex);通过体外凝胶迁移实验(EMSA)对Rex蛋白与DNA的结合活性进行分析。原核表达并纯化了 Rex重组蛋白(rSsRex)。Rex蛋白与自身启动子Prex特异性结合,高浓度的NADH抑制两者的结合活性,而NAD+对结合没有影响。通过体外结合试验发现Rex是通过响应NADH/NAD+平衡来调控自身基因的表达。2、猪链球菌2型转录调控因子Rex缺失株的构建及互补株的构建构建猪链球菌2型强毒株SS2-1转录调控因子Rex基因缺失株及互补株。利用猪链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET4s构建中间为氯霉素抗性基因,两侧为Rex编码基因上、下游同源序列的基因缺失质粒pSET4s::Rex,将缺失质粒电转到猪链球菌感受态细胞中,利用氯霉素抗性筛选Rex基因缺失株,通过PCR和DNA测序证明缺失株构建成功。将Rex基因通过链球菌-大肠杆菌穿梭质粒pSET2回补到Rex基因缺失株,经PCR和DNA测序鉴定证明互补株构建成功,为后续的生物学特性研究奠定基础。3、猪链球菌2型Rex基因缺失株生物学特性分析为进一步研究猪链球菌2型Rex基因的功能,本试验比较了亲本株、Rex基因缺失株和互补株在生物体内外的差异特性。试验结果表明,Rex基因缺失株,亲本株和互补株在生长特性,革兰染色形态、溶血活性、对HEp-2细胞的粘附和侵袭能力上无明显差异;氧化耐受和酸碱耐受试验发现△Rex对酸性杀伤和氧化杀伤更为敏感,差异显著(P<0.05)。为研究上述表型产生的分子机制,运用iTRAQ标记的定量蛋白组学方法比较Rex基因缺失株及其亲本菌株的蛋白质表达谱,共鉴定出96个差异表达蛋白,其中39个蛋白表达上调,57个蛋白表达下调。下调基因dpr编码一个Dps家族的氧化抵抗蛋白,导致缺失株对氧化应激敏感性增加。动物试验结果表明,Rex基因缺失株对小鼠毒力显著下降,半数致死量LD50是亲本株7倍;而且容易从小鼠体内清除,猪全血存活试验中Rex基因缺失株在猪全血中的存活能力显著降低(P<0.01),且进一步试验发现缺失株在巨噬细胞存活能力显著下降(P<0.01)。研究结果表明Rex基因通过影响猪链球菌2型对生存环境的适应能力,进而影响细菌的致病性。