十二指肠贾第虫（简称贾第虫）是一种人兽共患原生动物类寄生虫,是最为常见的肠道寄生虫之一,其可以感染包括人类在内的多种哺乳动物和鸟类,是引起世界范围内水源性腹泻的主要原因。贾第虫生活史包括包囊和滋养体两个阶段,其中滋养体定殖于十二指肠,能够通过吸附盘附着在十二指肠上皮细胞表面。通过与上皮细胞的相互作用从而引其腹泻、吸收不良和体重减轻等一些不良症状,半胱氨酸蛋白酶是原生寄生虫重要的毒力因子,它在寄生虫病的发病机制和寄生虫的生命周期中发挥着至关重要的作用,而贾第虫半胱氨酸蛋白酶在贾第虫病的发病过程中也起着重要的作用。过去的研究已经证实贾第虫半胱氨酸蛋白酶与肠道屏障的破坏和肠道微生物菌群失调有着重要关系。贾第虫组织蛋白酶B作为贾第虫半胱氨酸的主要组成成分,其具有很高的水解活性,能够破坏宿主细胞的紧密连接和肠道粘液屏障,并与宿主细胞凋亡和免疫因子的降解有关。已有研究发现,贾第虫能够引起宿主肠上皮细胞和树突细胞的细胞凋亡。此外,贾第虫刺激还能诱导宿主巨噬细胞的促炎反应以及细胞焦亡,然而在这些过程中,贾第虫半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶作为贾第虫重要的毒力因子,是否在上述过程中发挥作用尚不清楚。本研究分别建立了贾第虫滋养体与杯状细胞、肠上皮细胞和巨噬细胞的体外互作模型,利用组织蛋白酶B抑制剂和组织蛋白酶B重组蛋白来探究组织蛋白酶B对宿主细胞粘蛋白表达及分泌、细胞凋亡和细胞炎症反应的影响,旨在探究贾第虫组织蛋白酶B在贾第虫与宿主细胞体外互作过程中发挥的功能。本研究首先对贾第虫组织蛋白酶B的七种蛋白cat B-1～7进行了生物信息学分析,并构建了原核表达质粒p Clod-cat B-1～7,成功表达纯化了cat B-1～7蛋白。我们还成功构建了贾第虫滋养体与肠上皮细胞、杯状细胞和巨噬细胞的互作模型,利用贾第虫与杯状细胞互作模型探究贾第虫贾第虫组织蛋白酶B对宿主细胞粘蛋白表达及分泌的影响,首先利用western blot对贾第虫引起的粘蛋白的表达和分泌水平进行了检测。然后利用贾第虫半胱氨酸蛋白酶抑制剂（E-64）和组织蛋白酶B抑制剂（CA-74 Me）,运用q PCR、western blot以及间接免疫荧光技术对贾第虫组织蛋白酶B对杯状细胞粘蛋白的m RNA水平和蛋白水平的影响进行了检测分析。结果显示,贾第虫滋养体刺激能够诱导杯状细胞粘蛋白MUC2的分泌,而贾第虫引起的杯状细胞MUC2的快速分泌导致了细胞内MUC2的快速消耗。此外,q PCR结果显示贾第虫刺激能够诱导杯状细胞粘蛋白m RNA水平上调,这也证实了贾第虫能够通过调控细胞粘蛋白的m RNA水平来增强宿主细胞的粘蛋白表达。然而当贾第虫半胱氨酸蛋白酶或组织蛋白酶B被抑制后,贾第虫诱导宿主细胞m RNA水平上调的能力受到了抑制。这也证实了贾第虫组织蛋白酶B参与了该过程。此外,研究结果还显示半胱氨酸蛋白酶或组织蛋白酶B被抑制后,贾第虫刺激导致的胞内MUC2快速消耗的现象却受到了一定程度的抑制,这说明了贾第虫通过诱导杯状细胞粘蛋白MUC2的快速分泌从而引起胞内MUC2的快速消耗。为了进一步确认调控杯状细胞表达和分泌的组织蛋白酶B,本研究还利用贾第虫体外直接刺激杯状细胞,并利用q PCR和western blot对MUC2的m RNA和蛋白水平分别进行了检测分析。结果表明cat B-1和cat B-6分别引起了杯状细胞MUC2的表达上调和下调。而其余的组织蛋白酶B重组蛋白刺激没有引起杯状细胞MUC2的表达水平的显著性变化。上述研究结果揭示了贾第虫组织蛋白酶B可能通过诱导MUC2的快速分泌来实现胞内MUC2的消耗的。与此同时,贾第虫还可以利用cat B-1和cat B-6分别上调和下调MUC2的表达水平。这也说明了贾第虫组织蛋白酶B家族作为重要的毒力因子,在贾第虫调控宿主细胞粘蛋白表达分泌过程中发挥着复杂的作用。这也使我们进一步明确了贾第虫组织蛋白酶B在贾第虫调控宿主肠道粘膜屏障过程中发挥的作用。本研究利用贾第虫与肠上皮细胞、杯状细胞互作模型,对贾第虫组织蛋白酶B对宿主细胞凋亡的影响进行了评价。研究首先对贾第虫引起的肠上皮细胞Caco-2和杯状细胞LS174T的PRAP和CASP3的剪切水平进行了western blot分析,然后利用半胱氨酸蛋白酶抑制剂E-64和组织蛋白酶B抑制剂CA-74 Me对贾第虫组织蛋白酶B对细胞凋亡的影响进行评价。研究还利用间接免疫荧光对贾第虫组织蛋白酶B对Caco-2细胞的CASP3剪切水平的影响进行检测。最后使用ROS检测试剂盒对组织蛋白酶B对Caco-2中ROS的影响进行了评价分析。结果显示,滋养体体外刺激肠上皮细胞和杯状细胞均激活了凋亡效应蛋白CASP3和PARP的剪切,这揭示了滋养体引发上皮细胞和杯状细胞凋亡现象。而E-64和CA-74 Me的使用抑制了贾第虫引起的CASP3和PARP的激活,这说明贾第虫组织蛋白酶B在贾第虫诱导肠上皮细胞和杯状细胞的细胞凋亡过程中发挥作用。ROS的检测结果也显示贾第虫刺激引起了肠上皮细胞Caco-2的ROS的大量产生,然而组织蛋白酶B被抑制后贾第虫引起的ROS产生水平却受到了一定抑制,该结果也揭示了贾第虫组织蛋白酶B可能通过调控ROS的产生来调控细胞凋亡。而重组蛋白刺激Caco-2细胞的研究发现cat B-1和cat B-2能够直接激活CASP3的剪切,结果表明贾第虫的cat B-1和cat B-2参与了贾第虫诱导的宿主细胞凋亡。本研究基于贾第虫与巨噬细胞的互作模型,来探究贾第虫组织蛋白酶B在贾第虫诱导的炎症反应过程中发挥的作用。我们分别对贾第虫刺激引起RAW 264.7和J774A.1细胞的促炎症因子IL-1β、TNFα、IL-6以及炎症小体NLRP3的m RNA水平的变化进行了检测,贾第虫刺激引起了上述基因的转录水平的上调。而进一步利用半胱氨酸蛋白酶或组织蛋白酶B抑制剂预处理贾第虫,研究发现贾第虫半胱氨酸蛋白酶和组织蛋白酶被抑制之后滋养体刺激引起的促炎症因子IL-1β、TNFα的m RNA上调水平受到了一定抑制。为了进一步确认哪一种或哪几种组织蛋白酶B在其中发挥作用,我们进一步利用重组蛋白刺激巨噬细胞,并对IL-1β、TNFα的m RNA水平进行检测,结果显示cat B-1和cat B-6重组蛋白的直接刺激均能够引起巨噬细胞IL-1β、TNFα的m RNA水平的上调。上述结果揭示了贾第虫能够诱导巨噬细胞的炎症反应,且该过程可能是通过cat B-1和cat B-6上调促炎因子IL-1β和TNFα来参与实现的。综上所述,本研究首次发现了贾第虫不仅能够诱导杯状细胞粘蛋白MUC2的快速分泌,还可以通过上调粘蛋白MUC2的m RNA水平来增强宿主细胞的粘蛋白表达,而贾第虫组织蛋白酶cat B-1和cat B-6均直接参与调控了杯状细胞粘蛋白表达。此外,研究还发现了贾第虫组织蛋白酶B不仅诱导了肠上皮细胞凋亡,也参与了贾第虫诱导的巨噬细胞炎症反应,其中cat B-1和cat B-2参与并调控肠上皮细胞凋亡,而cat B-1和cat B-6能够通过上调IL-1β和TNF-α的表达水平来调节贾第虫引起的巨噬细胞炎症反应。本研究为以后贾第虫致病机制以及宿主抗贾第虫感染的免疫调节机制的研究提供了有力依据,也为临床上贾第虫病的防治提供新的思路。