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目的分离培养人牙髓细胞,探讨其基本的增殖、分化等生物学特性,通过利用电容耦合电刺激牙髓细胞,研究其对体外培养人牙髓细胞增殖的影响,以探索利用微电流环境在牙组织工程中应用的前景。方法从正畸减数拔除的年轻恒前磨牙中分离、培养牙髓细胞,传代三代至八代的细胞用于生物学特性试验研究:1、利用相差显微镜观察系细胞的一般形态. 2、记录细胞的生长曲线. 3、流式细胞术检测其表面分子的表达. 4、诱导矿化,通过免疫组化及逆转录-聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)等鉴定其诱导分化的结果。在生物学研究的基础上,对体外培养的人牙髓细胞施加场强30V/cm ,频率分别为5、25、50、75、100KHz的电容耦合电刺激,30min/d,连续作用4d,观察不同频率电容耦合电刺激对人牙髓细胞体外增殖作用的影响,对照组正常状态培养,从以下方面检测电容耦合电刺激对人牙髓细胞增殖的影响: 1、倒置显微镜下观察细胞的形态改变. 2、MTT法检测细胞活性及增殖情况. 3、流式细胞仪测定细胞期。结果本实验中人牙髓细胞在体外可多次传代培养而保持旺盛的生长状态,其生长曲线在8-10天达到平稳,流式细胞术结果显示,CD44、CD90、CD147均为阳性,这与间充质干细胞的免疫表型相一致。经矿化诱导培养后,免疫组化结果显示牙本质涎蛋白染色阳性,茜素红染色有矿化结节形成以及碱磷酶表达升高,RT-PCR,DSPP表达阳性。经电容耦合电刺激后结果显示:1、不同频率的电刺激作用后细胞形态和对照组无明显差别。2、MTT检测显示经电容耦合电刺激后的人牙髓细胞增殖能力和对照组明显不同,其中50Hz刺激组生长曲线最高,明显快于其他频率刺激组(P<0.01)。3、流式细胞仪检测表明,经电容耦合电刺激作用以后,所有样本均未发现有DNA倍体异常的细胞(diploid:100%);人牙髓细胞细胞周期发生了改变,S期细胞百分比和刺激频率有关。结论本实验从人年轻恒牙获得的人牙髓细胞易于分离培养,细胞状态较原始,具有干细胞特性,经诱导可分化为成牙本质细胞,提示其具有作为牙组织工程种子细胞的潜能。频率是影响电容耦合电刺激细胞生物学效应的重要因素之一,频率不同,其产生的促细胞增殖效应不一,50kHz可能是促进人牙髓细胞体外增殖的适合频率。