研究背景原发性肝癌(Primary liver cancer, PLC,以下简称肝癌)是临床上最常见的恶性肿瘤之一,其恶性程度高,自然生存期短,且发病隐匿,早期缺乏典型症状,大部分病人确诊时已属中晚期,丧失了手术根治的机会,且肝癌术后5年总生存率仍不够理想。化疗是治疗肝癌必不可少的手段之一,但传统化疗药物的长期应用使癌细胞耐药现象越来越普遍,大大影响了化疗药物的临床应用；同时,化疗药物产生的毒副作用如骨髓抑制、免疫抑制、胃肠道反应等也使大部分患者难以耐受。采用联合化疗方案用于肝癌的治疗可减少化疗药物毒副作用,延缓肿瘤耐药性的发生,提高化疗效果。白血病(Leukemia)是一类造血干细胞的恶性克隆性疾病,是造血系统最常见的恶性肿瘤。目前白血病的治疗以抗癌药的化学治疗为主。近年来对白血病发病机制的认识不断深入,各种联合化疗方案及支持疗法的日益完善,加上造血干细胞移植技术的逐步应用,白血病的预后已有所改观。但化疗的多药耐药性(Multiple drug resistance, MDR)、化疗后昂贵的支持治疗费用、化疗药物的副作用、干细胞移植技术尚不成熟等等一系列问题,使得目前白血病的治疗仍然存在较大的困难。寻找疗效好、毒副作用小、成本低、少耐药的药物,已成为当今相关研究的热点。青蒿素(Artemisinin)是从菊科艾属青蒿(Artemisia annua L.)茎叶中提取的一种含过氧基团的倍半萜内酯类化合物。青蒿素的半合成衍生物青蒿琥酯(Artesunate, Art)化学名为二氢青蒿素-1,2-α-2琥珀酸单酯,具有水溶性好、抗疟活性高等特点。青蒿琥酯作为一个临床已应用20余年的药物,其药物代谢过程、药物动力学研究、药物毒理学研究较为明确,为其进一步的临床应用研究打下了坚实基础。近年研究表明,青蒿琥酯除了良好的抗疟作用外,还具有抗肿瘤作用、免疫调节作用、抗血吸虫作用、抗肝脏损伤等作用,并且和某些药物还有协同作用,可增强抗癌药物的疗效,提升肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,减少抗癌药物的副作用,延缓耐药性的发生。顺铂(DDP)属于细胞周期非特异性药物,具有细胞毒性,可抑制肿瘤细胞的DNA复制,具有较强的广谱抗瘤作用。然而,顺铂也存在较多的不良反应,使其在癌症的治疗应用方面受到一定限制。Art联合DDP应用于肝癌细胞和白血病细胞的抑制增殖、诱导凋亡等方面是否具有明确协同作用,尚未完全明确,作用机制也有待于进一步探讨。因此,本研究采用MTT法检测Art、DDP两药单用和联用对肝癌细胞HepG2增殖的影响；CCK-8法检测Art、DDP两药单用和联用对白血病细胞K562增殖的影响; Annexin-V-PE/PI荧光双标记法检测Art、DDP两药单用和联用对HepG2细胞和K562细胞的凋亡作用；酶联免疫分析法检测Art、DDP两药单用和联用对HepG2细胞和K562细胞内端粒酶浓度的影响。亚铁螯合酶(ferrochelatase)亦称血红素合成酶(heme synthetase),位于细胞线粒体膜,催化亚铁离子嵌入原卟啉IX形成血红素,是血红素合成的关键酶之一,对于维持与血红蛋白、肌红蛋白和细胞色素相关的各种正常功能具有重要的意义。文献报道青蒿琥酯可导致血红蛋白合成受阻和骨髓幼红细胞成熟障碍,对小鼠骨髓造血干/祖细胞的增殖和分化具有明显抑制作用。青蒿琥酯的上述作用是否与其抗肿瘤活性存在相关性,是一个值得研究的问题。因此本研究还采用酶联免疫分析法检测Art、DDP两药单用和联用对昆明小鼠血清中亚铁螯合酶浓度的影响,以探讨青蒿琥酯是否可以通过抑制亚铁螯合酶、干扰血红素生成的途径产生协同抗肿瘤效应,为Art与DDP在肝癌以及白血病的联合化疗研究提供科学依据。目的1.研究Art联合DDP作用于肝癌HepG2细胞株和白血病K562细胞株在抑制细胞增殖、诱导凋亡等方面是否具有明确抗癌协同效果。2.探讨Art联合DDP抑制肿瘤细胞的作用与Art对亚铁螯合酶活性抑制的关系。方法1.MTT法检测HepG2细胞增殖接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔100μL DMEM完全培养基含3000个细胞,24h后,用等容积含有不同浓度Art、DDP及Art+DDP联合组的完全培养基替换孔内培养基,每组设5个复孔。不同时间处理后,加入MTT溶液10μL,继续培养4h,用等容积DMSO替换孔内培养基,震荡10min,在490nm波长下,以空白组OD值调零,酶联免疫分析仪测定各孔OD值,计算细胞存活率,数据以均数±标准差(x±s)表示。2.CCK-8法检测K562细胞增殖接种处理好的单细胞悬液于96孔板,每孔100μL DMEM完全培养基含3000个细胞,完全培养基中含有不同浓度Ar、DDP及Art+DDP联合组的完全培养基替换孔内培养基,每组设5个复孔。不同时间处理后,加入CCK-8溶液10μL,继续培养4h后在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,以空白组OD值调零,酶联免疫分析仪测定各孔OD值,计算细胞存活率,数据以均数±标准差(x±s)夕表示。3. Annexin V-PE/PI荧光双标记法检测HepG2和K562细胞的凋亡分别收集和计数HepG2细胞和K562细胞；各组细胞以l×105/孔接种于6孔板,每组设3个复孔,各孔加入Art或DDP诱导细胞凋亡,48h后,收集细胞,PBS洗涤细胞两次,2000r.p.m.离心5min,收集1×105-5×105细胞；吸取500μL1x Binding Buffer加入到细胞悬液里；然后加入5μl的Annexin V-PE和10μ1的PI；室温、避光,反应5-15min；流式细胞仪检测细胞凋亡率。4.酶联免疫分析法检测HepG2细胞和K562细胞内端粒酶的浓度分别收集和计数HepG2细胞和K562细胞；各组细胞以1x105／孔接种于6孔板,每组设3个复孔,各孔加入Art或DDP,48小时后,收集细胞,离心重悬,收集1×106/mL细胞,反复冻融使细胞裂解,收获细胞内成分。在酶标包被板中加入标准品和各组样品,温育,洗涤,然后加入HRP酶标试剂50μL,温育,洗涤,加入显色剂100μL,避光显色30min,再加入终止液50μL,在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,以空白组OD值调零,酶联免疫分析仪测定各孔OD值,计算标准方程和端粒酶浓度。5.酶联免疫分析法检测小鼠血清中亚铁螯合酶浓度KM小鼠40只,按体重分层后随机分为对照组,青蒿琥酯组(Art30mg/kg/d)、顺铂组(DDP lmg/kg/d)和联合给药组(Art30mg/kg/d+DDP1mg/kg/d),每组各10只,每日一次i.p(对照组i.p等容量生理盐水)14d后,断头处死小鼠取血,室温静置1h后离心,1000转离心10min,吸取上层血清。在酶标包被板中加入标准品和各组样品,温育,洗涤,然后加入HRP酶标试剂50μL,温育,洗涤,加入显色剂100μL,避光显色30min,再加入终止液50μL,在450nm波长下,酶联免疫分析仪测定各孔光吸收值,以空白组OD值调零,酶联免疫分析仪测定各孔OD值,计算标准方程和亚铁螯合酶浓度。6.统计学分析所有实验数据以均数±标准差(X±s)表示,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),并采用LSD法进行两两比较。P<0.05被认为差异具有统计学意义。采用SPSS13.0for windows统计软件包进行数据分析。结果1.Art联合DDP对肝癌细胞HepG2的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用：4μmol/L Art或4mg/L DDP单独处理组及4μmol/L Art联合4mg/L DDP组处理细胞24h、48h和72h后,细胞存活率分别为：116.09±±18.40%、84.08±6.54%、53.85±2.18%；100.55±10.19%、70.48±8.84%、52.36±9.83%；89.05±12.89%、37.69±3.87%、15.18±2.99%。联合处理组细胞凋亡率较单独使用Art或DDP组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,Art联合DDP组细胞凋亡率较单独采用Art或DDP组细胞显著增高。2.Art联合DDP对白血病细胞K562的增殖抑制、诱导凋亡具有协同作用：4μmol/L Art或4mg/L DDP单独处理组及4μmol/L Art联合4mg/L DDP组处理细胞24h、48h和72h后,细胞存活率分别为：100.63±9.71%、80.92±4.45%、59.85±7.93%；92.13±10.59%、67.40±4.53%、61.14±6.11%；44.78±2.40%、25.16±1.29%、22.82±6.43%。联合处理组细胞凋亡率较单独使用Art或DDP组明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,Art联合DDP组细胞凋亡率较单独采用Art或DDP组细胞显著增高。3.Art联合DDP对肝癌HepG2细胞、白血病K562细胞端粒酶活性的影响：肝癌细胞经4pmol/L Art或4mg/L DDP单独处理组及4μmol/L Art联合4mg/L DDP组处理48h后,端粒酶活性分别为：9.1144-0.004U/L、7.806±0.005U/L、13.317±0.004U/L,联合用药组明显高于Art或DDP单独处理组,差异具有统计学意义(P<0.01)；白血病细胞经4μmol/L Art或4mg/L DDP单独处理组及4μmol/L Art联合4mg/L DDP组处理48h后,端粒酶活性分别为：10.731±0.003U/L、7.806±0.008U/L、12.372±0.006U/L,联合用药组明显高于Art或DDP单独处理组,差异具有统计学意义(P<0.01)。4.Art联合DDP对昆明小鼠血清中亚铁螯合酶浓度的影响：KM小鼠腹腔注射生理盐水(0.5mL/只／d),Art(30mg/kg/d)、DDP(1mg/kg/d)以及Art (30mg/kg/d)联合DDP (1mg/kg/d)14d后,血清中亚铁螯合酶浓度分别为343.00±47.50pg/mL、196.15±37.77pg/mL、235.04±41.12pg/mL、161.59±23.78pg/mL,联合给药组和Art组明显低于阴性对照组DDP单独注射组,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论1.Art与抗癌药物DDP联合应用具有抑制人肝癌细胞HepG2和白血病细胞K562增殖作用,并促进癌细胞凋亡。2.与单用DDP比较,Art联合DDP导致小鼠血清中亚铁螯合酶浓度降低,Art的协同抗肿瘤作用机制可能与其抑制亚铁螯合酶、干扰血红素生成有关。