论文部分内容阅读
犬流感(Canine Influenza, CI)是由犬流感病毒(Canine influenza virus,CIV)引起的一种急性高度接触传染性呼吸道疾病。目前犬流感病毒已经存在于广西宠物犬群中,但流行程度并不高。但是,宠物犬作为人类伴侣动物,与人类关系非常密切,对宠物犬流感病毒的研究将对人类健康具有重大的公共卫生意义。本研究在2013年4月至12月期间,从广西各地级市收集了宠物犬鼻拭子326份,采用针对M基因的RT-PCR方法对样品进行检测,得到44份阳性样品,其阳性率达到达到13.4%。应用犬肾细胞(Madin-Darby canine kidney, MDCK)和鸡胚接种方法从阳性样品中分离到4株宠物犬流感病毒,分别命名为A/canine/Guangxi/L1/2013(H3N2)(简称为L1),A/canine/Guangxi/L2/2013(H3N2)(简称为L2),A/canine/Guangxi/LZ317/2013(H1N1)(简称为LZ317),A/canine/Guangxi/WZ11/2013(H1N1)(简称为WZ11)。其中,L1与L2的8个基因片段的核苷酸同源性达到99-100%,LZ317与WZ11株的8个基因片段亦达到99-100%。H3N2CIVs全基因片段遗传演化分析和核苷酸同源性比较发现,8个基因片段与早期的人类H3N2亚型流感病毒类Moscow/99亚群亲缘关系最为相近,与Moscow/10/99核苷酸同源性达到99%以上,而该毒株早在2000s年代在猪群中流行,其中PB2、PA、HA基因与A/swine/Henan/1/2010(H3N2)同源性最高,达99.6%以上；PB1、NP与A/swine/Shandong/3/2005(H3N2)同源性最高,达99.8%；NA、NS与A/swine/Zhejjang/01/2008(H1N2)司源性性最高,达99.7%以上。M基因与A/swine/Guangdong/L22/2010(H3N2)亲缘关系最为相近,同源性也达到99.8%。结果显示,这是首次从宠物犬上分离到早期流行于人类并且引入到猪体的完全人源流感病毒。根据HA基因推导的氨基酸裂解位点(PEKQTR↓G)分析,我们推断该毒株为低致病性毒株。同时,研究发现HA蛋白的190aa至196aa位点处,该毒株保留了循环在猪体受体相关结合位点(DQISVYA),但是却改变了流行于人类的部分受体结合位点(DQTSLYT)。此外HA1蛋白的226I和228S位点表明该毒株仍然保持与人的SAa-2,6-Gal受体结合。H1N1CIVs全基因片段遗传演化和核苷酸同源性分析发现,LZ317与WZ11株的HA、NA基因属于欧洲禽源谱系,分别与A/swine/Jiangsu/zg7/2010(H1N1)、A/swine/Jiangsu/zg5/2010(H1N1)同源性最高,分别达98.4%,98.8%。而NP、PB2、PB1、PA, M属于pdm09/H1N1亚群,同源性达到98.4-99.4%。LZ317与WZ11株的NS基因均与A/swine/Guangxi/BB1/2013(H1N1)的同源性最高,同源率分别为96.2%、98.1%,属于经典猪流感谱系。LZ317与WZ11株所获得的7个基因片段HA、NA、NP、NS、PB2、PB1、PA都与广西当前流行的三重重组猪流感(A/swine/Guangxi/BB1/2013(H1N1))的核苷酸同源性都很高,分别为98.1-98.2%,98.2%,99.3～99.4%,96.2-98.1%,98.8-99.6%,99.0-99.2%,99.0-99.8%。令人关注的是,M基因却与A/swine/Guangxi/BB1/2013(H1N1)不同,它们来源于pdm09/H1N1亚群,与A/Singapore/ON1079/2009(H1N1)亲缘关系最为相近,同源性达到99.2%-99.4%。结果表明,本研究所获得的H1N1CIVs为新型三重重组毒株。对HA基因推导的氨基酸分析发现,H1N1CIVs毒株的HA基因第190、225、226氨基酸均分别为D、E、Q,而228位有所不同,分别C和G,表明该毒株都可以与SAα-2,6-Gal和SAα-2,3-Gal受体结合；在HA裂解位点只有单个碱性氨基酸R；PB2基因第588、627、701位氨基酸分别为E、E、D;PA基因的第353位氨基酸为K；NS1第92位为D,且不具备PDZ配体功能域序列。说明LZ317和WZ11为低致病性毒株,但PB1-F2中的第12位氨基酸为终止密码子,显示LZ317和WZ11致病性和传播性将会变强。NA基因中119E,274Y,292C,294D和M2基因31N,表明LZ317和WZ11对奥司他韦和金刚烷胺类药物产生耐药性,但仍然对扎米那韦敏感。为了解H3N2和H1N1亚型犬流感在犬群中的流行情况,分别使用H3N2亚型L1株和H1N1亚型WZ11株作为抗原对来自广西区部分市区的宠物犬进行血清学调查,获得来自2013年H1N1阳性血清14份,阳性率为3.2%,1份来自2011年,阳性率达到0.9%,但是未获得H3N2亚型阳性血清。因此,我们推断H3N2CIVs可能并未在宠物犬中流行,但是新型三重重组H1N1CIVs已经开始在犬群中呈小规模流行,并且早在2011年就已出现。这些人源H3N2CIVs和新型重组H1N1CIVs的存在,充分证明了宠物犬将逐渐成为流感病毒生态循环中不可缺少的中间宿主。因此,加强对宠物犬流感的监测,有利于我们了解人类流感的流行情况,为防控对人类流感大暴发提供理论支持和提前预警。