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目的:我们的前期研究发现,MAGE-D4在多种肿瘤中具有免疫原性,可刺激机体产生MAGE-D4自身抗体,然而本课题组检测血清抗体时使用的是MAGE-D4全长蛋白,难以确定这种抗原抗体反应是否受MHD的干扰。因此,本研究的目的是构建MAGE-D4 N-端截短蛋白重组质粒,制备MAGE-D4 N-端截短融合蛋白,并进一步检测脑肿瘤患者血清中抗体的存在情况,分析其临床意义。方法:（1）运用IEDB在线软件预测MAGE-D4蛋白的B细胞和T细胞抗原表位,并以此为基础确定扩增区域。（2）以本实验室前期构建的MAGE-D4cDNA为模板,PCR扩增出N-端398（1-398AA）个氨基酸序列的cDNA,构建MAGE-D4/pColdⅡ重组质粒,并转化至JM109宿主菌进行扩增,经蓝白斑筛选、DNA测序正确后,再将重组质粒转化BL-21（DE3）pLysS 表达宿主。（3）体外诱导表达 His-tag/MAGE-D41-398aa截短蛋白,优化IPTG的诱导浓度及诱导时间,经SDS-PAGE电泳分析、Western-Blotting及飞行质谱鉴定正确后,大量表达制备His-tag/MAGE-D41-398aa截短蛋白,采用Ni-NTA树脂亲和纯化后,获得MAGE-D4 N-端截短蛋白。（4）建立基于MAGE-D41-398aa截短蛋白的间接ELISA法;检测脑膜瘤、髓母细胞瘤、胶质瘤及胶质母细胞瘤等4种常见脑肿瘤共175例患者血清和63例正常人血清中抗MAGE-D4抗体的阳性率;并与基于MAGE-D4全长蛋白的间接ELISA法进行比较;结合临床病理资料,初步分析MAGE-D4自身抗体出现的临床意义。结果:（1）IEDB分析结果显示,MAGE-D4蛋白的N-端含有较多的B细胞表位和T细胞表位,然而MHD区域亦包含少量B细胞优势表位和较多的T细胞表位;（2）pColdⅡ/MAGE-D4测序与已知序列完全相同;（3）成功诱导表达出His-tag/MAGE-D41-398aa截短蛋白;优化了His-tag/MAGE-D41398aa截短蛋白体外表达的最佳条件:37℃振荡培养2小时后,迅速冷却至20℃以下,加入终浓度为0.9mmol/L的IPTG,20℃恒温诱导24小时;表达出与预计分子量接近、氨基酸序列完全正确的截短蛋白;（4）ELISA结果显示,脑肿瘤患者血清抗MAGE-D4抗体的总体阳性率为21.14%（37/175）,其中,星形细胞瘤22.22%（24/108）,胶质母细胞瘤22.22%（8/36）、室管膜瘤50%（5/10）、脑膜瘤8.57%（3/35）、髓母细胞瘤28.57%（4/15）;血清MAGE-D4抗体的阳性率与胶质瘤患者的临床病理参数无明显关联;血清MAGE-D4抗体（+）的患者与MAGE-D4抗体（-）的患者的中位生存期无显著差异（13个月Vs.16个月,P=0.752）,单因素分析显示年龄（>45岁）、WHO分级（Ⅲ-Ⅳ级）和组织学分型（胶质母细胞瘤）与更短的生存期明显相关,多因素分析显示,组织学分型（胶质母细胞瘤）是唯一的预后因子;与基于MAGE-D4全长蛋白的间接ELISA法相比,两种蛋白的阳性检出率无显著差异,符合率为65.71%。结论:本研究提示,MAGE-D4全长蛋白的抗原表位并非完全集中在N-端,因此利用截短蛋白而不是全长蛋白开展免疫相关的研究或许是至关重要的。我们成功构建了 pColdⅡ-MAGE-D4原核重组质粒,体外获得了纯度较高的MAGE-D41-398aa截短蛋白。基于MAGE-D41-398aa截短蛋白的间接ELISA法则初步证实MAGE-D4在多种脑肿瘤中具有免疫原性,能够诱发特异性的体液免疫反应,然而关于血清MAGE-D4抗体在临床上的应用尚需大样本的研究。