本论文的研究内容涉及到分析化学、材料化学以及生物化学等二级学科，旨在将现代的分离分析技术应用于糖蛋白的高效富集和糖链结构的鉴定，以及酪氨酸蛋白激酶的抑制剂筛选和选择性评价。论文主要分为以下两部分:　　第一部分:糖蛋白的高效富集和亲水性寡糖样品的分离及结构鉴定　　蛋白的糖基化是一类重要的翻译后修饰过程。糖蛋白中糖链结构不仅影响蛋白质的性质，如折叠、稳定性和溶解性等，而且在细胞识别、信号转导、细胞粘合以及免疫应答等多种细胞过程中发挥重要作用。对于复杂的生物样本中，蛋白种类繁多动态范围极广，要对低丰度的糖蛋白进行研究，需要选择性地富集样本。此外，治疗性糖蛋白的糖链结构直接影响其疗效和安全性。因此，对其糖链结构的深入表征在糖蛋白药物产品的研发、生产和质量控制中具有重要意义。　　我们发展了一种简易的制备核/壳/壳结构(Fe3O4@SiO2@PGMA)磁性纳米粒子的方法，只需要在一般条件下，就可以制备出高性能的磁性纳米粒子用于亲和富集糖蛋白。Fe3O4@SiO2@PGMA具有8nm的Fe3O4磁性粒子作为内核，以硅胶层以及种子聚合的聚缩水甘油醚甲基丙烯酸酯(PGMA)外壳构成。伴刀豆凝集素通过亲水的聚乙二醇连接臂共价交联到粒子表面，用于特异性地富集人血清中的糖蛋白。采用离线的二维色谱和高分辨生物质谱对富集的糖蛋白进行分析，一共鉴定出72种糖蛋白。鉴定丰度最低的蛋白是β-2-glycoprotein1，它在血清中的浓度为1×10-6 mg/mL。我们富集到的蛋白动态变化范围达到了八个数量级，证明我们的粒子特异性非常好，血清样品本身的蛋白浓度对富集过程影响较小。　　新型促红细胞生成素（NESP，商品名Aranesp）是高度糖基化的蛋白类激素，临床上用于治疗慢性肾衰竭引起的贫血。NESP糖基化翻译后修饰中N-糖链结构与药物的半衰期、活性等密切相关。我们提出一种新的全面分析NESP中N-糖链结构的策略:即用毛细管电泳(CE)结合糖昔外切酶测序技术对糖链的构成模块(building blocks)进行自下而上（bottom-up）的定性定量分析，另一方面即用超高效亲水相互作用色谱/飞行时间质谱(UPLC/Q-TOF-MS)对完整糖链结构进行自上而下(top-down)的轮廓分析(profiling)。两种方法提供了糖链完整的结构信息。Bottom-up分析中需要将糖链用多种特异性糖苷外切酶进行单一酶切和混合酶切成building blocks。用建立的毛细管电泳方法进行分离，鉴定出组成单糖的连接方式:核心α1-6岩藻化、末端α2-3唾液酸化以及β1-4半乳糖。通过UPLC/Q-TOF-MS可以鉴定出所有N-糖链末端唾液酸的O-乙酰化异构体。这一研究成果为新型促红细胞生成素的药物质量控制以及结构与生物活性关系研究提供了关键技术。此外，本文中利用链蛋白酶有效地酶解糖蛋白新型促红细胞生成素，利用LC-MS/MS鉴定了NESP样品酶解后的多肽片段和糖肽片段，碰撞诱导解离分析，推导出O-糖肽中糖链的结构有三种类型GalNAcGal(NeuAe)2、GalNAcGal(NeuAc)、GalNAcGal。最后，我们用4，5-亚甲二氧基-1，2-苯二胺盐酸盐(DMB)为柱前荧光衍生试剂，建立了应用于新型促红细胞生成素中唾液酸的定性定量分析的高效液相分离-荧光检测的分析方法。　　同时将之前发展的结合弱阴离子交换色谱以及毛细管电泳的二维分离平台进一步应用于免疫球蛋白G以及人血清中N-糖链的结构鉴定中。初步建立了人血清中N-糖链的指纹图谱(profilling)，将方法应用于乳腺癌患者的特异性N-糖链差异性分析。实验中对乳腺癌的未见淋巴转移和伴有淋巴转移患者血清的糖链分别进行了考察。结果发现与正常对照组相比，唾液酸化程度增加，岩藻糖化程度和平分型的N-乙酰半乳糖的糖型含量降低。同时伴有淋巴转移的患者血清与未见淋巴转移相比，这种差异性更加明显。　　近年来，亲水相互作用色谱(HILIC)在糖链分离分析中得到了快速应用，为了发展用于糖链分析的新的HILIC固定相，本文制备出三种新型亲水整体柱材料。具体实验设计是，以PETA作为交联剂、META为带电单体和极性不同的两性离子功能性单体MPC、SPE、SPP分别制备成poly(MPC-co-PETA-co-MET),poly(SPE-co-PETA-co-META)，poly(SPP-co-PETA-co-META)三款亲水性整体柱。制备好的亲水性整体柱需进行聚合条件的优化和色谱性能参数的测定，来选择出渗透性良好、柱效高和分离能力强的最优化整体柱。以毛细管电色谱为平台，应用于酚类、胺类、核苷类等极性化合物的分离中，获得了很好的效果。之后，选择合适的亲水整体柱对小分子药物盐酸普拉克索及其杂质进行了定性定量分析，5 min内实现化合物的基线分离，快速且高效。同时，也考察了我们制备的亲水整体柱对大脑神经递质类化合物的分离分析。保留时间合理、峰型对称，以及柱效很高理论塔板数可以达到200，000 plates/m。　　第二部分:酪氨酸蛋白激酶表皮生长因子受体(EGFR)的抑制剂筛选和选择性评价研究　　蛋白激酶参与调控了几乎所有的细胞生理活动，如细胞的生长、分化、代谢和凋亡。表皮生长因子受体(EGFR)是一种广泛分布于哺乳动物上皮细胞的跨膜糖蛋白，是受体酪氨酸蛋白激酶家族代表性的一类，也是目前抗肿瘤治疗研究的重要靶点。我们发展了毛细管电泳-激光诱导荧光(CE-LIF)用于表皮生长因子受体的抑制剂筛选和选择性评价。选取了EGFR的997位自磷酸化位点荧光标记的肽段作为底物，通过激酶反应，底物肽被蛋白激酶磷酸化，然后利用CE-LIF进行分离和检测。激酶的活性可以通过磷酸化肽的量来确定。实验中，考察了不同的pH、温度、孵育时间以及酶浓度对激酶反应活性的影响。在最优条件下，首先通过已知抑制剂ZD1837和OSI-744对激酶筛选体系进行了验证。最终，将其应用于39种中药粗提物组成的化合物库中进行了筛选，对筛选的活性粗提物进行进一步的活性成分追踪。最终，鉴定得到泽兰中槲皮素和芦丁是EGFR的抑制剂，其IC50分别为0.88μM和10.1μM。