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第一部分急性哮喘小鼠模型的建立与评价目的通过补充完善急性哮喘动物模型评价标准,探讨建立的急性哮喘小鼠模型是否成功。方法35只SPF级雌性BALB/c小鼠随机分为两组：哮喘组(20只)以OVA致敏、激发；正常对照组(15只)以等体积的PBS代替OVA致敏、激发,末次激发24 h后处理小鼠。查看小鼠的一般行为活动；雾化吸入Ach行支气管激发试验,有创肺阻抗法测定小鼠的气道反应性；BALF行细胞学分类、计数；HE染色观察肺组织的病理变化。研磨小鼠脾脏制成单个核细胞悬液,裂解红细胞,免疫磁珠分离小鼠脾源性CD4+T细胞,悬于加有胎牛血清的RPMI 1640培养液,ConA和PMA刺激培养24小时后,计算脾源性CD4+T细胞总数；流式仪检测Th17细胞的阳性率；ELISA测定BALF和脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-4和IL-17的浓度。结果(1)哮喘组小鼠出现类似于人的哮喘发作症状,而正常对照组小鼠表现正常。(2)与正常对照组相比,哮喘组小鼠对Ach的刺激反应明显,浓度反应曲线上移(均P<0.01)。(3)与正常对照组相比,哮喘组小鼠肺组织支气管及血管周围大量炎性细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞)浸润(P<0.01)。(4)与正常对照组相比,哮喘组小鼠BALF中白细胞总数、Neu(％)、Eos(％)和Lym(%)显著增多(均P<0.01)。(5)与正常对照组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞总数和Th17细胞阳性率显著增高(均尸<0.01)。(6)与正常对照组相比,哮喘组小鼠BALF和脾源性CD4+Υ细胞培养上清中IL-4和IL-17的浓度显著增高(均P<0.01)。(7)急性哮喘小鼠BALF中IL-17的浓度与Neu(%)显著正相关(r=0.903,P<0.01)。结论1.对脾源性CD4+T细胞总数、Th17细胞阳性率和细胞培养上清中IL-17浓度的检测,可做为急性哮喘动物模型的评价标准。2.本实验中建立的急性哮喘小鼠模型是成功的。第二部分IL-23受体对急性哮喘小鼠脾源性Th17细胞增殖和致炎机能的影响目的通过检测IL-23受体的表达、Th17细胞阳性率和IL-17的浓度,探讨IL-23受体对急性哮喘小鼠脾源性Th17细胞增殖和致炎机能的影响。方法Th17细胞的阳性率反应其增殖情况,细胞培养上清中1L-17的浓度反应Th17细胞的致炎机能。免疫磁珠分离的小鼠脾源性CD4-T细胞悬于加有胎牛血清的RPMI-1640培基、ConA和PMA刺激培养24小时,real-time PCR和WB测定小鼠脾源性CD4+T细胞亚群Th17细胞中1L-23受体的表达,流式仪测定Th17细胞的阳性率,ELISA测定脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度,并分析哮喘组小鼠IL-23受体的表达和Th17细胞阳性率、IL-17浓度的相关性。结果(1)与正常对照组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-23受体mRNA的表达显著增高(P<0.01)。(2)与正常对照组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-23受体蛋白的表达显著增高(P<0.01)。(3)与正常对照组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中Th17细胞的阳性率显著增高(P<0.01)。(4)与正常对照组相比,哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度显著增高于(P<0.01)。(5)哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-23受体mRNA的表达与Th17细胞的阳性率显著正相关(Υ=-0.789,P<0.05)；与IL-17的浓度显著正相关(Υ=0.788,P<0.05)。(6)哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-23受体蛋白的表达与Th17细胞的阳性率显著正相关(r=0.828,P<0.01)；与IL-17的浓度显著正相关(r=0.802,P<0.05)。结论1.急性哮喘小鼠脾源性CD4+T细胞中IL-23受体的表达、Th17细胞的阳性率和IL-17的浓度均显著增高。2.急性哮喘小鼠中IL-23受体的表达可能影响Th17细胞的增值和致炎机能。第三部分下调T-bet表达通过影响1L-23受体促进Th17细胞的增殖和致炎机能目的通过抑制T-bet的表达,观察对急性哮喘小鼠脾源性Th17细胞增殖和致炎机能的影响。方法T-bet为观察对象,IL-23受体为联系T-bet和Th17细胞的桥梁,Th17细胞的阳性率反应其增殖情况,细胞培养上清中IL-17的浓度反应Th17细胞的致炎机能。三对siRNA-T-bet片断和阴性对照,分别瞬时转染哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞后,Western Blot和real-timePCR检测T-bet的表达,筛选出具有最佳沉默效果的片断,此片断转染哮喘组小鼠脾源性CD4+T细胞。3组细胞：正常对照组、未转染哮喘组和转染最佳沉默siRNA片断哮喘组的脾源性CD4-T细胞,悬于加有胎牛血清的RPMI-1640培基、ConA和PMA刺激培养24小时,检测各组细胞中T-bet的表达、IL-23受体的表达、Thl7阳性率和细胞培养上清中IL-17浓度,并分析转染最佳沉默siRNA片断哮喘组的脾源性CD4-T细胞中T-bet的表达与IL-23受体的表达、Th17阳性率、IL-17浓度的相关性。结果(1)三对siRNA片断中以siRNA-T-bet-429沉默效果最为显著(P<0.01)。(2)与正常对照组相比,未转染哮喘组和转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中T-bet mRNA的表达显著降低(均P<0.01)；与未转染哮喘组相比,转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中T-bet mRNA的表达显著降低(P<0.01)。(3)与正常对照组相比,未转染哮喘组和转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4-T细胞中T-bet蛋白的表达显著降低(均P<0.01)；与未转染哮喘组相比,转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中T-bet蛋白的表达显著降低(P<0.01)(4)与正常对照组相比,未转染哮喘组和转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中IL-23受体mRNA的表达显著增高(均P<0.01)；与未转染哮喘组相比,转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中IL-23受体：mRNA的表达显著增高(P<0.01)。(5)与正常对照组相比,未转染哮喘组和转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中IL-23受体蛋白的表达显著增高(均P<0.01)；与未转染哮喘组相比,转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中IL-23受体蛋白的表达显著增高(P<0.01)。(6)与正常对照组相比,未转染哮喘组和转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中Th17的阳性率显著增高(均P<0.01)；与未转染哮喘组相比,转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中Th17的阳性率显著增高(P<0.01)(7)与正常对照组相比,未转染哮喘组和转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度显著增高(均P<0.01)；与未转染哮喘组相比,转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞培养上清中IL-17的浓度显著增高(P<0.01)(8)转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中T-bet mRNA的表达与IL-23受体mRNA的表达显著负相关(Υ=-0.786,P<0.05),与Thl7阳性率显著负相关(Υ=-0.882,P<0.01),与IL-17的浓度显著负相关(Υ=-0.893,P<0.01)。(9)转染siRNA-T-bet-429哮喘组的脾源性CD4+T细胞中T-bet蛋白的表达与IL-23受体蛋白的表达显著负相关(Υ=-0.873,P<0.01),与Th17阳性率显著负相关(Υ=-0.786,P<0.05),与IL-17的浓度显著负相关(r=-0.939,P<0.01)。结论1.急性哮喘中下调T-bet的表达可促进Th17细胞的增值和IL-17的分泌。2.急性哮喘中T-bet可能通过IL-23受体影响Th17细胞的增值和致炎机能。