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研究背景:视网膜母细胞瘤（Retinoblastoma,RB）是5岁以下儿童中最常见的一种眼内高度恶性肿瘤,其进展非常迅速,主要通过破坏眼球结构导致患儿失明。全球的RB患儿有43%都分布在亚太地区,而中国的RB患儿占全球患儿的13.6%。目前针对RB的治疗方案在进一步完善,化疗是最常见的治疗方法,而卡铂是最常用的化疗药物,临床上常使用卡铂与其他药物联合进行化学治疗,但是RB患儿的存活率依旧很低,据报道部分原因是由于RB对化疗药物的耐药性增加导致的。因此,明确RB耐药机制,寻找可能抑制耐药的靶点进行联合治疗有望增加RB患儿的存活率。胶质细胞源性神经营养因子（Glial cell derived neurotrophic factor,GDNF）是转化生长因子-β（transforming growth factor-beta,TGF-β）超家族的成员,是一种分泌蛋白。有文献报道,GDNF通过与糖基磷脂酰肌醇连接的GDNF受体α（glycosylphosphatidylinositol-linked GDNF receptor alpha,GFRα）蛋白结合,进而招募受体酪氨酸激酶（Receptor tyrosine kinase,RET）,从而对靶细胞产生影响。GDNF在胶质瘤、肺癌和胰腺癌中过表达,但GDNF在RB中的表达尚未见报道。近年来,微小RNA（micro RNA,miRNA）被报道与肿瘤细胞的侵袭性和耐药密切相关,调控micro RNA可通过促进自噬促进RB耐药,提高化疗敏感性。自噬是通过隔离自噬囊泡中的细胞器和蛋白质并将细胞质载体递送至溶酶体以降解,继而保证肿瘤细胞在代谢和化疗药物的作用下存活。但由于miRNA mimics一般存在多个结合位点,所以可能有较大概率脱靶。此外,因为miRNA不稳定且血清中存在大量RNase酶降解RNA,所以miRNA的体内运输存在一定问题。寻找miRNA下游分子机制,针对下游靶点设计药物联合卡铂等化疗药物,可能更好地治疗RB。研究目的:进一步研究GDNF促进RB耐药的分子机制,为设计药物治疗靶点进而联合卡铂治疗RB从而减弱其耐药性提供充分的理论依据。研究方法:1、本文通过对视网膜母细胞瘤细胞系Y79构建耐药细胞株Y79R,然后进行RNA-seq测序。生信分析中的GO和KEGG富集分析发现差异基因在药物转运功能中明显富聚。然后我们选择其中变化最明显的GDNF和miR-211-5p进行下一步分析,在Y79R中,敲低GDNF的表达或过表达miR-211-5p,用CCK-8实验检测Y79R的IC50,流式细胞学实验检测Y79R的凋亡细胞,WB检测凋亡相关蛋白cleaved PAPR1、Bcl-2、Bax的蛋白表达水平。双荧光素酶试验和WB实验验证miR-211-5p与GDNF的关系。2、为进一步挖掘GDNF引起Y79R耐药的其他机制,我们对测序结果进行进一步生信分析,发现差异基因在自噬相关通路中富集。为了明确GDNF对Y79R细胞株自噬及凋亡的影响,我们在Y79R中敲低和过表达GDNF后,用CCK-8检测细胞IC50;流式检测细胞凋亡,q PCR检测自噬相关的基因的m RNA水平表达,WB检测凋亡相关蛋白cleaved PAPR1、Bcl-2、Bax和自噬相关蛋白LC3I、LC3II,p62的表达水平;使用电子显微镜检测自噬小体的形成。3、为了在体内证明GDNF对Y79卡铂耐药的作用我们构建了裸鼠成瘤模型。利用过表达和沉默GDNF的Y79R细胞干预裸鼠皮成瘤,使用免疫组化检测肿瘤组织中GDNF蛋白的表达情况及TUNEL检测肿瘤组织凋亡水平。研究结果:1、成功构建耐卡铂细胞模型Y79R后测序发现GDNF在药物转运相关基因中表达水平升高最明显,在可能与GDNF相互作用的基因中,miR-211-5p表达水平降低最明显。双荧光素酶试验表明miR-211-5p可以直接结合GDNF 3’-UTR,WB实验表明miR-211-5P可以抑制GDNF蛋白水平的表达。敲低GDNF和过表达miR-211-5p降低Y79R细胞的IC50,使Y79R细胞的凋亡增多。2、生信分析提示GDNF在Y79R细胞中的引起的卡铂耐药可能与自噬相关。在Y79R细胞中过表达GDNF后,CCK-8实验发现Y79R细胞IC50升高;流式细胞术结果表明Y79R细胞凋亡减少;WB结果表明凋亡相关蛋白减少,自噬相关蛋白LC3I向LC3II转化增加,p62减少;电镜也显示自噬小体增加;而在过表达GDNF的Y79R细胞中加入早期自噬抑制剂3-MA后,Y79R细胞IC50降低,细胞凋亡增加;自噬相关蛋白LC3I向LC3II转化减少,p62表达升高,自噬小体减少。结果说明GNDF可能通过诱导早期自噬影响RB耐药。3、CCK-8实验表明过表达miR-211-5P能降低Y79R细胞IC50,使Y79R细胞凋亡增多,凋亡相关蛋白cleaved PAPR1表达水平升高,自噬相关蛋白LC3I向LC3II转化降低,p62蛋白升高;而在过表达miR-211-5p的Y79R细胞中过表达GDNF后,Y79R细胞IC50升高,Y79R细胞凋亡减少,凋亡相关蛋白cleaved PAPR1表达水平降低,LC3I向LC3II转化增多,而p62表达减少。结果说明miR-211-5p通过GDNF促进Y79R细胞的自噬和耐药,抑制细胞凋亡。4、qPCR和WB结果显示GFRA1,RET,p-SRC,p-AMPK,自噬相关蛋白LC3I向LC3II在过表达GDNFY79R细胞中转化增加,p62降低。CCK-8实验说明过表达GDNF使Y79R细胞的IC50升高,而敲低GFRA1抑制Y79R细胞的IC50。流式细胞术结果显示,过表达GDNF使Y79R细胞凋亡减少,而敲低GFRA1使细胞凋亡增加。结果说明GDNF通过与自身细胞膜表面的受体GFRA1形成复合物引起下游的自噬通路激活,进而使细胞凋亡减少,最终引起卡铂耐药。5、相对于正常的Y79细胞,Y79R干预下裸鼠的皮下瘤体生长速度和瘤体大小明显增加,组织细胞凋亡减少;沉默GDNF的Y79R细胞干预下裸鼠的皮下瘤体生长速度和瘤体大小明显减小,组织细胞凋亡增加,过表达GDNF的Y79R细胞干预下裸鼠的皮下瘤体生长速度和瘤体大小明显增加,组织细胞凋亡减少;自噬抑制剂氯喹能明显抑制过表达GDNF的Y79R细胞干预下裸鼠的皮下瘤体生长速度和瘤体大小,促进组织细胞凋亡。小鼠体内实验结果与细胞实验结果一致。研究结论:1、Mi R-211-5p下调导致GDNF表达上调引起Y79R的卡铂耐药,减少Y79R细胞的凋亡。2、GDNF通过与受体GFRA1结合形成GDNF/GFRA1复合体,并以复合体的形式激活SRC及SRC-AMPK信号通路,进而激活早期自噬,抑制凋亡,促进Y79R的卡铂耐药。